혼성화(hybridization) 연쇄반응 RNA Whole-Mount Fluorescence In situ Hybridization of Chemosensory Genes in Mosquito Olfactory Appendages
Summary
이 기사에서는 모기 안테나와 상악 팔프에서 화학 감각 수용체 유전자의 공간 및 세포 분해능에 대한 통찰력을 밝히기 위해 혼성화 연쇄 반응 RNA 전체 장착 형광 in situ 교잡(HCR, RNA WM-FISH)을 수행하는 데 필요한 방법과 시약을 설명합니다.
Abstract
모기는 치명적인 질병의 효과적인 매개체이며 후각 부속기에서 발현되는 화학 감각 수용체를 사용하여 화학적 환경을 탐색할 수 있습니다. 화학감각 수용체가 말초 후각 부속기에서 어떻게 공간적으로 조직되어 있는지 이해하면 냄새가 모기 후각계에서 어떻게 암호화되는지에 대한 통찰력을 제공하고 모기 매개 질병의 확산을 막는 새로운 방법을 알려줄 수 있습니다. 3세대 혼성화 연쇄 반응 RNA 전체 장착 형광 in situ 교잡화(HCR, RNA, WM-FISH)의 출현으로 여러 화학 감각 유전자의 공간 매핑 및 동시 발현 프로파일링이 가능합니다. 여기에서는 Anopheles 모기 안테나와 상악 손바닥에서 HCR RNA WM-FISH를 수행하기 위한 단계적 접근 방식을 설명합니다. 우리는 이온성 후각 수용체의 발현 프로파일을 조사하여 이 기술의 민감도를 조사했습니다. 설명된 HCR WM-FISH 기법이 RNA 프로브를 스펙트럼적으로 구별되는 3개의 형광단에 테더링하여 다중 연구에 적합한지 물었습니다. 그 결과 HCR RNA WM-FISH가 더듬이와 상악 팔 후각 부속기에서 여러 화학 감각 유전자를 동시에 검출할 수 있도록 매우 민감하다는 증거가 제공되었습니다. 추가 조사를 통해 이중 및 삼중 RNA 표적의 동시 발현 프로파일링에 대한 HCR WM-FISH의 적합성이 입증되었습니다. 이 기술은 변형과 함께 적용될 때 다른 곤충 종의 후각 조직이나 다른 부속지의 관심 유전자를 국소화하는 데 적응할 수 있습니다.
Introduction
Anopheles gambiae와 같은 모기 매개체는 복잡한 화학 세계에서 번성하기 위해 말초 후각 부속지에서 발현되는 풍부한 화학 감각 유전자 레퍼토리에 의존하며, 인간 숙주에서 나오는 행동 관련 냄새를 식별하고, 꿀 공급원을 감지하고, 산란 부위를 찾습니다1. 모기 안테나와 상악 손바닥에는 이러한 후각 부속 기관에서 냄새 감지를 유도하는 화학 감각 유전자가 풍부합니다. 리간드 개폐 이온 채널의 세 가지 주요 부류는 모기의 후각 부속지에서 냄새 감지를 유도합니다: 의무 냄새 수용체 공동 수용체(Orco)와 함께 기능하는 냄새 수용체(OR); 하나 이상의 IR 코어 수용체(IR8a, IR25a 및 IR76b)와 상호 작용하는 이온성 수용체(IR); 화학 감각 미각 수용체 (GRs), 이산화탄소 (CO2)를 검출하기 위하여 3개의 단백질의 복합물로 기능하는1,2.
RNA 형광 in situ hybridization은 내인성 mRNA3의 발현을 검출하기 위한 강력한 도구입니다. 일반적으로 이 방법은 표적 mRNA에 상보적인 염기서열을 가진 형광단 태깅 단일 가닥 핵산 프로브를 사용합니다. 형광 RNA 프로브를 표적 RNA에 결합하면 관심 전사체를 발현하는 세포를 식별할 수 있습니다. 최근의 발전으로 이제 전체 마운트 모기 조직에서 전사체를 검출할 수 있게 되었다 4,5. 1세대 하이브리드화 연쇄 반응(HCR) 기술은 RNA 기반 HCR 증폭기를 사용했습니다. 이것은 HCR 증폭기 6,7에 대해 엔지니어링된 DNA를 대신 사용하는 2세대 방법에서 개선되었습니다. 이 업그레이드로 신호가 10배 증가하고, 생산 비용이 크게 절감되었으며, 시약의 내구성이 크게 향상되었습니다 6,7.
프로토콜에서는 모든 유전자 8,9의 공간적 국소화 및 발현을 검출하기 위해 설계된 3세대 HCR 전체 장착 RNA 형광 in situ hybridization(HCR RNA WM-FISH) 방법의 활용에 대해 설명합니다. 이 2단계 방법은 먼저 관심 mRNA에 특이적이지만 개시제 인식 서열도 포함하는 핵산 프로브를 사용합니다. 두 번째 단계에서는 형광 신호를 증폭하기 위해 개시제 시퀀스에 결합하는 형광단 표지 헤어핀을 사용합니다(그림 1). 이 방법은 또한 두 개 이상의 RNA 프로브를 멀티플렉싱하고 프로브 신호를 증폭하여 RNA 검출 및 정량화를 용이하게 한다8. 후각 부속기에서 발현되는 화학 감각 유전자의 전사체 풍부도 및 RNA 국소화 패턴을 시각화하면 화학 감각 유전자 기능 및 냄새 코딩에 대한 첫 번째 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
3세대 혼성화 연쇄 반응(hybridization chain reaction, HCR)은 여러 RNA 표적을 시각화할 수 있는 감도와 견고성으로 주목할 만하다8. HCR WM-FISH는 초파리, 닭, 생쥐 및 제브라피쉬의 배아뿐만 아니라 선충류 및 제브라피시의 유충에도 성공적으로 사용되었습니다 10,16,17. 모기 더듬이와 상악 손바닥은 일반적으로 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aedes aegypti 후각 부속기에 대한 현장 교잡 프로토콜을 공유해 주신 Margo Herre와 Leslie Vosshall 연구실에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 C.J.P.(NIAID R01Al137078), J.I.R.의 HHMI Hanna Gray 펠로우십, J.I.R.의 Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award, J.I.R.의 Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship의 지원을 받았습니다. 존스 홉킨스 말라리아 연구소(Johns Hopkins Malaria Research Institute)와 블룸버그 자선재단(Bloomberg Philanthropies)의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
Referências
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