Summary
Hier presenteren we een protocol voor de actieve plaatsvermijdingstest, een hippocampus-afhankelijk ruimtelijk leerparadigma ontworpen voor knaagdieren. Door belangrijke parameters te wijzigen, kunnen dieren voor en na behandelingen of in de loop van de tijd opnieuw worden getest.
Abstract
Hippocampus-afhankelijk ruimtelijk leren bij knaagdieren is getest met behulp van verschillende methoden. Deze omvatten het Morris-waterdoolhof (MWM), Y-doolhof en taken voor het lokaliseren van nieuwe objecten (NOL). Meer recentelijk is de taak van actieve plaatsvermijding (APA) ontwikkeld als alternatief voor deze meer traditionele benaderingen. In de APA-taak moeten muizen ruimtelijke aanwijzingen gebruiken die rond een roterende arena zijn geplaatst om een stationaire schokzone te vermijden. Door de vele parameters die kunnen worden aangepast, is gebleken dat de APA-taak een zeer veelzijdige aanpak is. Het leent zich ervoor om longitudinaal en herhaaldelijk te worden gebruikt voor hetzelfde cohort muizen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om de APA-taak met succes uit te voeren. We belichten ook alternatieve APA-benaderingen die kunnen worden gebruikt om verschillende componenten van ruimtelijk leren te onderzoeken. We beschrijven de processen voor het verzamelen en analyseren van gegevens. Kritieke stappen tijdens de APA-taak worden besproken om de kans op het succesvol uitvoeren van de test te vergroten. De APA-taak heeft verschillende voordelen ten opzichte van meer traditionele ruimtelijke navigatietests. Het is geschikt voor gebruik bij oudere muizen of muizen met ziektefenotypes zoals de ziekte van Alzheimer. De complexiteit van de taak kan gemakkelijk worden gewijzigd, waardoor een breed scala aan muizenstammen kan worden getest. Verder is de APA-taak geschikt voor het testen van dieren die een operatie of experimentele ingrepen hebben ondergaan die de motorische of neurale functie kunnen hebben beïnvloed, zoals een beroerte of traumatisch hersenletsel.
Introduction
Actieve plaatsvermijding (APA) is een effectief hulpmiddel om hippocampus-afhankelijk ruimtelijk leren bij knaagdieren te testen 1,2,3,4. Tijdens de APA-taak wordt het dier op een roterende arena geplaatst en moet het visuele aanwijzingen gebruiken om zich te oriënteren en een aversieve schokzonete vermijden 5. De rotatie van de arena zorgt ervoor dat de muis geen idiothetische benadering voor navigatie kan gebruiken, noch kunnen geurmarkeringen worden gebruikt, aangezien deze signalen op het platform draaien terwijl de schokzone stil blijft5. Door de snelheid en richting van de arena te veranderen, evenals de locatie van de schokzone en visuele aanwijzingen, kunnen muizen meerdere keren opnieuw worden getest 6,7,8. De APA biedt een aantal duidelijke voordelen ten opzichte van het Morris-waterdoolhof (MWM), een van de meest gebruikte ruimtelijke leertests. Belangrijk is dat muizen een afkeer hebben van zwemmen en de MWM-taak extreem stressvol vinden9. Verder is gemeld dat oude muizen zweven tijdens de MWM-taak10, waardoor het in veel gevallen ongeschikt is als ruimtelijke leertaak. Verder, omdat de MWM-taak een verborgen, ondergedompeld platform vereist dat de muizen tijdens het testen kunnen lokaliseren. Dit vereist dat het water ondoorzichtig is, wat meestal wordt bereikt door de toevoeging van witte verf. Het volgen en analyseren van dieren tijdens gedragstaken vereist voldoende contrast tussen de proefpersoon en de omgeving, waardoor bepaalde muizenstammen zoals Swiss of BALB/c niet worden getest in de MWM. In de APA-taak wordt dit probleem omzeild door de toevoeging van zwart plastic onder het rooster.
Er zijn meerdere APA-paradigma's ontworpen om ruimtelijk leren te testen en het nut ervan als een effectief gedragsinstrument aan te tonen. Het verwerven, behouden en consolideren van ruimtelijk leren wordt bijvoorbeeld meestal bereikt door dagelijks testen van dieren die kunnen variëren van 3-5 dagen 6,7,11,12. Geheugen en leren worden gekwantificeerd door het aantal schokken dat elke acquisitiedag wordt ontvangen te vergelijken. De tijd tot de eerste binnenkomst en de maximale tijd om de schokzone te vermijden, zijn ook belangrijke parameters die kunnen worden gebruikt om veranderingen in het leervermogen tijdens de taak te bepalen. Als alternatief kan het ruimtelijk werkgeheugen worden getest door een enkele APA-sessie van 30 minutenuit te voeren 2,13 waarbij ruimtelijk leren wordt gemeten als veranderingen binnen de sessie door prestaties, zoals het schokgetal, te vergelijken in bakken van 5 minuten.
In dit artikel beschrijven we de APA-taak en belichten we de belangrijkste kenmerken waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van deze ruimtelijke leertest.
Protocol
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Universiteit van Queensland volgens de richtlijnen van de National Health and Medical Research Council of Australia (goedkeuringsnummer: QBI/189/15).
1. Opstelling van de APA-ruimte
OPMERKING: Het APA-apparaat bestaat uit een verhoogde arena met een metalen roostervloer omsloten door een transparante cirkelvormige grens van 32 cm hoog. De metalen staven zijn gelijkmatig verdeeld (0,5 cm uit elkaar) en hebben een diameter van 0,3 cm.
- Zorg ervoor dat het APA-apparaat zich binnen het cameraframe bevindt dat aan het plafond is gemonteerd. Volg de muis met behulp van in de handel verkrijgbare software voor het volgen van dieren.
- De APA-arena draait over het algemeen met een snelheid van 1 tpm en een vooraf aangewezen stationaire schokzone van 60° is ingesteld binnen de roterende arena. Wanneer de muis de schokzone binnengaat, geef dan een milde voetschok van 0.5 mA (60 Hz, 500 ms).
- Zorg ervoor dat de locatie van de schokzone tijdens het testen constant blijft en elektronisch is ingesteld binnen de experimentele opstelling. De roterende arena brengt de muis naar de schokzone, tenzij de muis actief beweegt om deze te vermijden.
- Plaats vier nieuwe visuele aanwijzingen op vier verschillende kamermuren op dezelfde hoogte als het roterende platform, meestal op 30-50 cm afstand van de arena. Zorg ervoor dat de aanwijzingen neutrale kleuren zijn, zoals zwart-witsymbolen of vormen die op A3-papier zijn gedrukt en gelamineerd voor eenvoudige reiniging (Afbeelding 1A).
- Zorg ervoor dat de lichtintensiteit van de kamer tussen de 30-70 Lux ligt. Het verhogen van de lichtintensiteit veroorzaakt angstachtig gedrag en vermindert exploratie.
- Open voordat u begint het Tracker-programma en selecteer de APA-taak.
- Selecteer in de opties voor Tracker 2D het tabblad Experiment . Zorg er hier voor dat Plaatsvermijding - Eén frame - Alleen positie is geselecteerd. Dit maakt het mogelijk om de vereiste parameters te configureren. Sla het configuratiebestand op en pas het indien nodig aan.
- Stel op het tabblad Experiment de duur van het experiment in het vak Experimenttijd in. Een typische duur van een experiment is 600 s of 10 minuten.
- Zorg ervoor dat de optie Timer inschakelen is geselecteerd. Wijzig de schokparameters in het timergebied zoals hierboven besproken.
- Voer de algemene experimentele details in de daarvoor bestemde ruimte in het gebied Ruimteframe van het tabblad Experiment . Zorg er bijvoorbeeld voor dat de naam van het standaarduitvoerbestand wordt ingevuld met de datum, een eenvoudige experimentele identificatie en de dag van testen. Beëindig de naam met een onderstrepingsteken "_" om de toevoeging van een unieke muis-ID tijdens het experiment mogelijk te maken.
- In het gebied Ruimteframe bevindt zich ook het tabblad Doelen . Klik op de knop Bewerken om de mogelijkheid te bieden om ervoor te zorgen dat de hele arena wordt opgenomen in de regio van interesse. Selecteer vervolgens Arc om de instelbare parameters voor de grootte en locatie van de schokdoelzone op te geven (Figuur 1B).
- Open het tabblad Tracking om de parameters aan te passen om een succesvolle tracking van muizen te garanderen. Het contrastvak heeft de opties Donker of Licht om zowel donkere (bijv. C57Bl/6) als lichte (bijv. BALB/c) muizen mogelijk te maken. Dit zorgt voor een effectief contrast tussen de achtergrond en de muizen. Als u albinostammen van muizen gebruikt, plaats dan een stuk zwart plastic onder de arena om dit contrast te bereiken (Figuur 2).
- Stel de grootte en het gebiedsbereik van de muis in dit gebied in. Stel deze parameters in om de muis effectief te herkennen wanneer deze zich in de arena bevindt. U kunt deze ook instellen na het indrukken van de knop Van kalibrator .
- Selecteer de knop Van kalibrator om ervoor te zorgen dat de arena zich volledig in het interessegebied van het masker bevindt.
- Start de arena op dit tabblad om ervoor te zorgen dat wanneer de arena draait, de arena in het masker blijft. Dit tabblad is ook van cruciaal belang om de juiste contrastdrempel te selecteren. Verplaats de rode lijn in het deelvenster Drempel om de contrastdrempel aan te passen.
OPMERKING: Figuur 3A toont een optimale drempelselectie, zoals blijkt uit een effen oranje gebied en een blauwe "X" waar de muis zich bevindt. Een slechte drempel wordt weergegeven in figuur 3B en toont alleen gespikkeld oranje en geen "X".
- Start de arena op dit tabblad om ervoor te zorgen dat wanneer de arena draait, de arena in het masker blijft. Dit tabblad is ook van cruciaal belang om de juiste contrastdrempel te selecteren. Verplaats de rode lijn in het deelvenster Drempel om de contrastdrempel aan te passen.
- Gebruik het tabblad Apparaten en stel de draairichting en snelheid van de arena in met behulp van de snelheidsknop. Selecteer zowel positieve als negatieve snelheden, die rotaties met de klok mee en tegen de klok in vertegenwoordigen. Stel de schokintensiteit in het gedeelte Huidige bron in. De meest gebruikelijke instelling voor muizen is 1 rpm rotatie en een schok van 0,5 mA.
- Wijzig hoe of wanneer de schokken moeten worden toegediend op het tabblad Huidige bron .
- Zorg ervoor dat de huidige modus is geselecteerd op Afhankelijk van volgen. Dit geeft een elektrische schok wanneer de muis in de schokzone beweegt.
- Selecteer Tijd om schokken te geven met een door de gebruiker ingesteld tijdsinterval. Gebruik eerder opgenomen nummers om een muis te schokken door Uit bestand te selecteren. Dit is om een controlemuis met een juk te bieden die wordt onderworpen aan een identiek aantal schokken met dezelfde duur en intensiteit, onafhankelijk van ruimtelijk leren.
OPMERKING: Met de tabbladen Bestandsuitvoer en Venster kunnen gegevens- en videobestanden in een specifieke map worden opgeslagen. Met de knop Van afbeelding op het tabblad Bestandsuitvoer kunt u ook het interessegebied vastleggen dat de hele arena moet worden geselecteerd.
- Trek je terug achter het gordijn en begin de proef. De aanwezigheid van de onderzoeker in de buurt van de arena en onnodig lawaai kunnen de prestaties van het dier beïnvloeden.
- Zorg ervoor dat eventuele ruis en geur tijdens de proef worden beperkt, wat de muis een ander signaal kan geven dat zijn prestaties beïnvloedt. Voorbeelden om dit tot een minimum te beperken, zijn onder meer het zorgen voor een gesloten klinische afvalbak, het gebruik van ruimtes die verwijderd zijn van lawaaierige laboratoriumruimtes en het grondig reinigen van de apparatuur tussen de muizen. Onderzoekers kunnen overwegen om de witte ruisgenerator te gebruiken om niet-gerelateerde externe geluiden te maskeren.
- Laat het beddengoed van de thuiskooi gedurende de gedragstestperiode hetzelfde blijven, omdat dit nieuwe stimulatie kan geven en het gedrag kan beïnvloeden.
- Om dagelijkse variaties te voorkomen, voert u elke dag op een vast tijdstip tests uit.
2. Gewenning aan de omgang met de experimentator
- Behandel elke muis dagelijks gedurende 30 s tot 1 minuut gedurende ten minste 2-3 dagen vóór het testen. Het hanteren van dieren vermindert stress en angstgerelateerd gedrag tijdens het testen aanzienlijk.
- Gebruik dezelfde laboratoriumjas en vermijd het dragen van sterke deodorants, eau de cologne of parfum tijdens de gewenning en het testen.
3. Gewenning aan de APA-arena (1 dag)
- Breng de muis naar de voorkamer of testkamer voor gewenning. Laat de muis minimaal 30 minuten wennen. Stel de lichtintensiteit in de voorkamer of testruimte in voordat muizen worden binnengebracht om te wennen.
- Stel de Tracker-software in.
- Maak een map die specifiek is voor het experiment. Afhankelijk van het experimentele paradigma, heb je aparte mappen voor elke dag of proef. Stel experimentconfiguraties in zoals hierboven beschreven en sla deze configuraties op voor toekomstig gebruik.
- Voordat u een proefversie start, opent u de opgeslagen configuratie door op het tabblad Bestand te klikken, klikt u vervolgens op het symbool Opslaan , voegt u een unieke muis-ID toe in het nieuw geopende venster en voert u de proefversie uit door op het tabblad Afspelen te drukken.
- Laat de muis wennen aan het APA-apparaat door hem 5 minuten bloot te stellen aan de roterende arena zonder schokken te geven.
- Haal de muis uit de huiskooi door hem van de basis van de staart op te tillen en voorzichtig op de gehandschoende hand te leggen. Transporteer de muis naar het APA-apparaat en plaats deze uit de buurt van de schokzone, met het gezicht naar de muur.
- Trek je terug achter het gordijn en begin de proef.
- Verwijder aan het einde van de test de muis en keer terug naar de thuiskooi.
- Vang alle urine en uitwerpselen op en reinig het rooster grondig met 80% (v/v) ethanol.
- Herhaal stap 3.4-3.7 voor alle muizen.
4. Acquisitietraining met behulp van APA (1-6 dagen)
- Stel de verlichting in de kamer in op dezelfde omstandigheden als op de dag van de gewenning.
- Breng de muis naar de voorkamer of testruimte en laat hem minimaal 30 minuten wennen.
- Stel de Tracker-software in zoals hierboven beschreven.
- Stel de duur van de proefperiode in.
- Zorg ervoor dat de stroombron is ingeschakeld en ingesteld (d.w.z. 0.5 mA).
- Plaats de muis op de arena, weg van de schokzone en met het gezicht naar de muur.
- Trek je terug achter het gordijn en begin de proef door op de afspeelknop te drukken. Houd de muis in de gaten op het computerscherm en grijp in indien nodig. De muis krijgt bijvoorbeeld geen schokken of lijkt overdreven gestrest, zoals blijkt uit overmatig springen of vocaliseren.
- Verwijder aan het einde van de test de muis en keer terug naar de thuiskooi.
OPMERKING: Zorg ervoor dat muizen de schokken ontvangen en erop reageren. Muizen reageren op de schok door achteruit te gaan en te vocaliseren. Als dit niet het geval is, krijgen ze de schok mogelijk niet. Dit kan te wijten zijn aan scat op het net of aan onvoldoende tracking. Daarom is het essentieel om het raster na elke proef op te schonen en de muistracking te optimaliseren, zoals hierboven besproken.
5. Reversal acquisitie training (optioneel, 1-6 dagen)
- Verplaats bij de omkeringstaak de schokzone naar een nieuwe locatie, meestal 180° vanaf de vorige positie. Beoordeel het vermogen van de muis om flexibel een nieuwe locatie in de schokzone te leren. De aanwijzingen in de kamer worden meestal niet veranderd tijdens het leren van omkering.
- Herhaal stap 3.4-3.7 voor alle muizen.
6. Sondeproef (optioneel, 1 dag)
- Meet in de sondeproef de tijd tot de eerste toegang en/of de maximale tijd om de schokzone te vermijden.
OPMERKING: Dit geeft geheugenconsolidatie aan na de acquisitiefase. Een goed getrainde muis zal gedurende een langere periode (>60 seconden) vermijden om de schokzone binnen te gaan, wat tekenen van ruimtelijk leren vertoont. - Stel de lichtintensiteit in de ruimte in zoals op de dag van de acquisitietraining.
- Wen de muis gedurende 30 minuten in de testruimte of voorkamer.
- Stel de Tracker-software in.
- Stel de duur van de proefperiode in op dezelfde tijd als de eerder uitgevoerde testperiode (bijvoorbeeld 10 minuten of 30 minuten, afhankelijk van de testparameters).
- Lever geen schokken toe voor deze proef.
- Plaats de muis aan de andere kant van de aversieve schokzone, met het gezicht naar de muur.
- Begin de proef en trek je terug achter het gordijn.
- Zorg ervoor dat de muis efficiënt wordt gevolgd.
- Houd de muis in de gaten op het computerscherm en stop de proef wanneer deze de schokzone binnengaat. Sommige onderzoekers geven er de voorkeur aan om de proef 5 minuten voort te zetten om te zien of de muis blijft terugkeren naar de shockzone.
- Pak de muis voorzichtig op en keer terug naar de thuiskooi.
- Zorg ervoor dat alle urine en uitwerpselen zijn opgevangen en dat het rooster grondig wordt gereinigd met 80% (v/v) ethanol.
7. Analyse van het spoor
OPMERKING: De uitvoering van de taak kan worden bereikt via verschillende trackingsoftware. Hieronder ziet u hoe de meegeleverde software wordt gebruikt om de prestaties tijdens de APA-taak te bepalen. In dit geval worden de gegevens geanalyseerd met behulp van het Track Analysis-programma .
- Om de gegevens te analyseren, opent u het Track Analysis-programma en selecteert u Vermijden in het vervolgkeuzemenu in het hoofdvenster.
- Klik op Taak toevoegen om de gegevensbestanden die tijdens de acquisitiefase zijn opgeslagen, in een nieuw venster te uploaden. Maak in Groepsnaam een groep om te analyseren, bijvoorbeeld dag 1 of tijdstip van analyse.
- Klik op de Output Directory om de locatie te selecteren om de geanalyseerde gegevens op te slaan.
- Voeg de bestanden toe die moeten worden geanalyseerd door op het tabblad Bestanden toevoegen te klikken en de bestanden van de lokale schijf te selecteren.
- Stel de te analyseren tijd in door op het tabblad Tijd instellen te klikken. Dit biedt de mogelijkheid om de periode te definiëren die zal worden geanalyseerd, d.w.z. 0 tot 600 s. U kunt ook de gegevens in bakken analyseren, d.w.z. 60 s.
- Zodra alle tracks zijn toegevoegd, klikt u op het tabblad Analyse en selecteert u Analyse uitvoeren om de gegevens te analyseren. De analyse zal verschillende mappen opleveren. De gegevens voor analyse bevinden zich in de map TBLfiles . Open deze gegevensbestanden in een spreadsheet en gebruik ze voor verdere analyse, d.w.z. paarsgewijze vergelijking of herhaalde metingen ANOVA.
OPMERKING: De analyse zal ook andere mappen opleveren, waaronder PS-bestanden met een beschrijving van één pagina van de muizen tijdens het testen, met een sporenkaart en waar de schokken zijn ontvangen.
Representative Results
Muizen met een intact ruimtelijk leervermogen zullen een afname van het aantal schokken vertonen tijdens opeenvolgende acquisitieproeven (Figuur 4A). Evenzo zal de maximale tijd die nodig is om de schokzone te vermijden, toenemen naarmate de muis leert om met succes weg te navigeren uit de schokzone (Figuur 4B). Muizen die niet in staat zijn om een effectieve vermijdingsstrategie te leren, zullen echter een constant aantal schokken vertonen voor elke acquisitieproef (Figuur 4A). Vaak krijgen muizen die de schokzone niet kunnen identificeren, meerdere schokken bij elke toegang tot de zone. Traceerkaarten zijn nuttig om voorbeelden te geven van muizen die leren de schokzone te vermijden (Figuur 4C) en muizen die de schokzone niet kunnen vermijden (Figuur 4D). In beide gevallen vertegenwoordigen deze sporenkaarten de laatste dag van de verwerving. De muis in figuur 4C ontving slechts 2 schokken, zoals weergegeven door de twee cirkels. Merk ook op dat de traceerkaart laat zien dat de muis het grootste deel van de tijd aan de andere kant van de schokzone doorbrengt, die wordt weergegeven door de rode wig. Omgekeerd kreeg de muis in figuur 4D meer schokken en laat de sporenkaart een ongeordend patroon zien. Voorbeelden van muizen die niet in staat zijn om met succes te leren de shockzone te vermijden, zijn muizen die een verminderde hippocampusneurogenese hebben als gevolg van oudere leeftijd, zoals blijkt uit de 18 maanden oude muizen (Figuur 4A,B- gewijzigd door Blackmore et al., 20217), chemische ablatie van onrijpe neuronen6 of hippocampuslaesies (zie Codd et al., 2020)8.
Het is belangrijk om een onderscheid te maken tussen een mislukte proef omdat de muis niet leert en een fout in de opstelling van de apparatuur. De twee meest voorkomende oorzaken voor slechte resultaten als gevolg van defecte apparatuur zijn een slechte tracking van de muis (Figuur 5A) of het niet krijgen van een schok van de muis. Slechte tracking kan voorkomen dat de muis een schok krijgt wanneer deze zich in de schokzone bevindt. Als alternatief kan slechte tracking onnauwkeurig een schok veroorzaken wanneer de muis zich niet in de zone bevindt. In beide gevallen voorkomt dit dat de muis een effectieve vermijdingsstrategie ontwikkelt. Slechte tracking kan worden opgelost door de drempelwaarde aan te passen op het tabblad "Van kalibrator". Slechte tracking wordt meestal gedefinieerd als meer dan 1000 slechte frames gedurende een periode van 10 minuten en komt zeer zelden voor. Slechte tracking kan een probleem worden bij oudere muizen, waar alopecia kan ontstaan. Wanneer de muis een schok krijgt, zal hij reageren door te spannen of, af en toe, te vocaliseren. De muis beweegt meestal, al is het maar een beetje, en is te zien op de live tracking-software. Wanneer de muis perfect stil blijft staan binnen de schokzone, wordt een duidelijke lijn van schokken weergegeven (Figuur 5B). Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de schokbox niet is ingeschakeld of dat de uitwerpselen tussen de spijlen vastzitten, waardoor de amplitude van de schok die aan het dier wordt toegediend, wordt verminderd.
Afbeelding 1: APA-apparaat, gedragsruimte en instelling van de schokzone. (A) Een voorbeeld van de opstelling van de testarena en de ruimte. APA-apparaten zijn verhoogd en in het midden van de kamer geplaatst, omgeven door nieuwe visuele aanwijzingen. Zwart-wit visuele aanwijzingen worden gebruikt op dezelfde hoogte als het platform. (B). De doelfunctie op het tabblad Experiment maakt het mogelijk om de hele arena te maskeren en creëert een locatie van de schokzone. In dit voorbeeld is een schokzone, weergegeven door de rode wig, gecreëerd op 270°. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: APA-opstelling voor albino-muizenstammen. De APA-arena kan worden ingesteld voor albinostammen van muizen, zoals BALB/c, door de optie Licht te selecteren op het tabblad Volgen en een zwarte arena-achtergrond te maken. Een albinomuis op een zwarte achtergrond zorgt voor een hoog contrast en biedt een betere muistracking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 3: Het aanpassen van de drempel voor het volgen van de muis is essentieel. De drempelwaarde moet op passende wijze worden aangepast om ervoor te zorgen dat de dieren tijdens de proef goed kunnen worden gevolgd. De drempelwaarde wordt aangepast door de rode lijn in het drempelvenster op het tabblad Van kalibrator te verplaatsen. (A) Een voorbeeld van een goede drempelselectie met een effen oranje gebied en een blauwe X op het object. (B) Een slechte drempel met gespikkeld oranje. Slechte tracking leidt tot het verlies van een dier in de arena of voorkomt dat de muis een schok krijgt wanneer deze zich in de schokzone bevindt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van de prestaties tussen jonge (10 weken) en oudere (18 maanden) muizen op een 5-daags leerparadigma en Trace-kaarten. (A) De 10 weken oude muizen kregen significant minder schokken in vergelijking met de 18 maanden oude muizen tijdens 5 dagen testen; Merk op dat het verschil in het aantal ontvangen schokken minimaal was op de eerste testdag tussen de groepen, maar jonge muizen met een intact geheugen leerden de toegang tot de schokzone sneller te vermijden dan de oudere groep. (B) De maximale tijdvermijding werd berekend als de maximale tijd die werd besteed aan het vermijden van de schok tijdens de proef van 10 minuten. De jongere muizen leerden snel om toegang tot de schokzone te vermijden in vergelijking met oudere muizen, wat suggereert dat de jonge muizen effectief leren. (C) De muis in deze sporenkaart kreeg slechts twee schokken, zoals weergegeven door de twee cirkels in deze acquisitieproef. Deze muis bracht ook meer tijd door in de arena tegenover de schokzone, die wordt weergegeven door de rode wig. (D) Deze muis ontving meer schokken en bracht meer tijd door in de buurt van de schokzone, wat suggereert dat ruimtelijk leren niet werd bereikt bij deze muis. Tweerichtings, herhalingsmeting ANOVA met Bonferroni post-hoctests werden gebruikt om de significantie te testen. Blz<0,0001. Panelen A en B zijn aangepast van Blackmore et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Traceerkaarten geven belangrijke informatie voor elke muis tijdens elke proef. (A) Let op de rechte lijnen die aanwezig zijn in dit voorbeeld van tracking. Dit komt doordat de trackingsoftware een muis tijdens de taak onjuist identificeert. (B) Een voorbeeld van goede tracking tijdens de proef. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 6: Volgvisualisatie en heatmap op verschillende programma's voor het volgen van dieren. Zowel (A) Programma 1 als (B) Programma 2 detecteren de locatie en beweging van het dier om volgplots te creëren om visueel te inspecteren of het dier de taak of het effect van de experimentele behandeling leert. Beide programma's tonen identieke trackplots van een dier dat de taak efficiënt heeft geleerd. (C) Er kan ook een heatmap worden gemaakt, die de identificatie van hotspots en de clustering van de datapunten vergemakkelijkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Concluderend is de actieve plaatsvermijdingstest een effectieve ruimtelijke leertaak die kan worden gebruikt op verschillende muizenstammen en experimentele omstandigheden. De APA-taak overwint de beperkingen die verband houden met andere paradigma's voor ruimtelijk leren14, zoals de MWM, die stressvol is voor de muizen, gemeten aan de hand van cortisolspiegels9. De MWM is ook ongeschikt voor oude muizen, waarvan is gemeld dat ze drijven tijdens de taak10. Hoewel andere ruimtelijke leertests, zoals de Barnes-doolhof en de nieuwe objectlocatietest, minder stressvol zijn, worden ze beperkt door hoe vaak herhaalde tests kunnen worden uitgevoerd op hetzelfde cohort muizen. Daarom is het belangrijkste voordeel van de APA-taak dat deze meerdere keren kan worden gebruikt, aangezien verschillende parameters kunnen worden aangepast om de nieuwheid te behouden. We hebben de APA-taak inderdaad tot 5 keer gebruikt op hetzelfde cohort muizen om het effect van hippocampusablatie en het daaropvolgende effect van lichaamsbewegingte onderzoeken 8. In elk geval werden de parameters, waaronder de rotatie van de arena, de schokzone en ruimtelijke aanwijzingen, tussen de tests gewijzigd. Dit was effectief om ervoor te zorgen dat de muizen ruimtelijke navigatie-aanwijzingen gebruikten om de taak opnieuw te leren, zoals blijkt uit het feit dat de controledieren begonnen met een hoog aantal schokken en vervolgens afnamen tijdens de daaropvolgende testdagen voor elke testperiode8. Aan het einde van een testparadigma van 5 dagen zijn we doorgaans van mening dat elk dier dat op de laatste dag meer dan 10 schokken heeft gekregen of een maximale vermijding van minder dan 60 s heeft, het paradigma niet heeft geleerd.
Naast de mogelijkheid om eenvoudig instellingen te wijzigen om meerdere rondes van ruimtelijke tests mogelijk te maken, zorgt de APA-taak ervoor dat muizen ruimtelijke navigatie moeten gebruiken om de schokzone effectief te vermijden. Dieren moeten bijvoorbeeld externe signalen gebruiken om de stationaire schokzone te lokaliseren en te voorkomen dat ze de stationaire schokzone betreden door ervan weg te navigeren5. Omdat de arena roteert, kunnen dieren geen idiothetische benadering gebruiken voor navigatie, noch kunnen ze exteroceptieve signalen zoals geur gebruiken, omdat deze signalen met de arena roteren terwijl de schokzone en ruimtelijke signalen stationair blijven5.
Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat muizen op de juiste manier wennen aan de onderzoeker en de APA-arena. De intensiteit van de voetschok moet ook worden geoptimaliseerd, omdat zowel een te lage als een te hoge schokintensiteit het vermogen van muizen om te leren en de taak uit te voeren in gevaar kan brengen5. De schokintensiteit is doorgaans ingesteld op 0.5 mA en mag niet hoger zijn dan 0.7 mA. Voor dieren die meer angstachtig gedrag vertonen, overweeg dan om zowel de lichtintensiteit als de intensiteit van de voetschok te verminderen. Verhoogde angst tijdens de APA-taak kan zich uiten als overmatig springen, ongecontroleerd rennen in de arena of langdurig bevriezen. Het hier beschreven protocol gebruikte een schokintensiteit van 0,5 mA, dezelfde intensiteit die eerder is gebruikt met BALB/c, waarvan bekend is dat het meer angstachtig gedrag vertoont15.
Hier beschrijven we de software voor het volgen van dieren die is geleverd door het bedrijf dat de actieve plaatsvermijdingsinstallatie heeft geleverd. Alternatieve software voor het volgen van video's is ook geschikt voor het analyseren van gedragsprestaties. Deze programma's kunnen ook de muisprestaties tijdens APA-taken nauwkeurig meten en analyseren. Deze programma's maken het mogelijk om verschillende zones en locaties binnen de APA-arena te creëren om gedrag te beoordelen. De arena-instelling voor een APA bestaat uit één driehoekige schokzone, waar het aantal ingangen, de tijd om voor het eerst binnen te komen en de tijd die in de schokzone wordt doorgebracht, worden gemeten. Er kunnen ook extra zones worden toegevoegd binnen de arena. We kunnen bijvoorbeeld een centrale zone of een zone tegenover de schokzone toevoegen om de doorgebrachte tijd en de afgelegde afstand in die zones te meten als een dierstrategie om de aversieve zone te vermijden. Deze programma's volgen het zwaartepunt van de muis, dat vervolgens wordt opgeslagen en boven het referentiekader wordt weergegeven voor visuele inspectie (Figuur 6A,B). Ten slotte is het ook mogelijk om een dichtheidsheatmap te maken voor individuele en groepsprestaties (Figuur 6C).
Bij het uitvoeren van de APA-taak zijn er mogelijke problemen die moeten worden aangepakt. Af en toe moeten muizen worden uitgesloten van de analyse omdat ze niet reageren op de schokzone. Zoals altijd moet uitsluiting alleen worden overwogen als ze voldoen aan vooraf gedefinieerde uitbijtervoorwaarden, bijvoorbeeld buiten 2 standaarddeviaties van het gemiddelde. Complexe gedragstaken zoals de APA vereisen doorgaans hoge N-waarden van dieren. We raden aan om een vermogensanalyse uit te voeren om de juiste steekproefomvang te berekenen voordat APA wordt uitgevoerd. Dit is afhankelijk van de gebruikte stam en de behandelingsgroepen. Uit ervaring blijkt dat een n-waarde van 10 of meer voor elke groep voldoende vermogen levert bij het uitvoeren van APA-experimenten. Het belangrijkste probleem met deze taak is het garanderen van een hoogwaardige tracking van de muis tijdens de taak. De gewenningsfase van de taak moet worden gebruikt om te bevestigen dat dit gebeurt. Muizen die niet reageren op een schok is vaak te wijten aan uitwerpselen tussen de roosterbalken. Het is daarom essentieel om de rig na elk dier schoon te maken en eventuele uitwerpselen of urine te verwijderen. Dit zal ook de stress verminderen voor de dieren die volgen. De APA-taak omvat doorgaans een paradigma van 5 dagen, wat enkele beperkingen kan opleveren voor onderzoeken met interventies die minder dan 5 dagen effectief zijn; Het kortetermijngeheugen of het verwerven van ruimtelijk leren kan echter nog steeds worden beoordeeld voor dergelijke onderzoeken met behulp van de 30 minuten durende benadering van één sessie.
Samenvattend geeft dit artikel een gedetailleerde beschrijving van hoe het paradigma voor actieve plaatsvermijding kan worden opgezet en gebruikt om het ruimtelijk leren van muizen te testen. De mogelijkheid om de omstandigheden te veranderen, zodat meerdere muizenstammen van verschillende kleuren kunnen worden getest, is een duidelijk voordeel ten opzichte van andere, meer traditionele ruimtelijke tests zoals de MWM. Verder maakt de wijziging van meerdere parameters herhaalde tests mogelijk, zodat de veranderingen in ruimtelijk leren nauwkeurig kunnen worden vergeleken tijdens verschillende experimentele paradigma's of tijdens fysiologische veroudering. In korte tijd is aangetoond dat de APA-test een nauwkeurig en effectief alternatief is voor hippocampus-afhankelijk ruimtelijk leren. In de toekomst kan de APA-taak worden gebruikt als een betrouwbare methode voor het beoordelen van therapeutische of oefeninterventies op cognitief en ruimtelijk gedrag bij zowel wildtype als transgene muizen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken de Animal Behaviour Facility van het Queensland Brain Institute (QBI) voor de ontwikkeling en het onderhoud van het apparaat dat in dit manuscript wordt beschreven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
References
- Cimadevilla, J. M., Fenton, A. A., Bures, J. Functional inactivation of dorsal hippocampus impairs active place avoidance in rats. Neurosci Lett. 285 (1), 53-56 (2000).
- Willis, E. F., Bartlett, P. F., Vukovic, J. Protocol for short- and longer-term spatial learning and memory in mice. Front Behav Neurosci. 11, 197 (2017).
- Blackmore, D. G., Brici, D., Walker, T. L. Protocol for three alternative paradigms to test spatial learning and memory in mice. STAR Protoc. 3 (3), 101500 (2022).
- Pastalkova, E., et al. Storage of spatial information by the maintenance mechanism of LTP. Science. 313 (5790), 1141-1144 (2006).
- Stuchlik, A., et al. Place avoidance tasks as tools in the behavioral neuroscience of learning and memory. Physiol Res. 62 (Suppl 1), S1-S19 (2013).
- Vukovic, J., et al. Immature doublecortin-positive hippocampal neurons are important for learning but not for remembering. J Neurosci. 33 (15), 6603-6613 (2013).
- Blackmore, D. G., et al. An exercise "sweet spot" reverses cognitive deficits of aging by growth-hormone-induced neurogenesis. iScience. 24 (11), 103275 (2021).
- Codd, L. N., Blackmore, D. G., Vukovic, J., Bartlett, P. F. Exercise reverses learning deficits induced by hippocampal injury by promoting neurogenesis. Sci Rep. 10 (1), 19269 (2020).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behav Brain Res. 198 (1), 247-251 (2009).
- van Praag, H., Shubert, T., Zhao, C., Gage, F. H. Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice. J Neurosci. 25 (38), 8680-8685 (2005).
- Zhou, X. A., et al. Neurogenic-dependent changes in hippocampal circuitry underlie the procognitive effect of exercise in aging mice. iScience. 24 (12), 103450 (2021).
- Leinenga, G., Gotz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 278ra33 (2015).
- Willis, E. F., et al. Repopulating microglia promote brain repair in an IL-6-dependent manner. Cell. 180 (5), 833-846 (2020).
- Lesburgueres, E., Sparks, F. T., O'Reilly, K. C., Fenton, A. A. Active place avoidance is no more stressful than unreinforced exploration of a familiar environment. Hippocampus. 26 (12), 1481-1485 (2016).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
