Immunofluorescerende etikettering in neusslijmvliesweefselsecties van allergische rhinitis-ratten via veelkleurige immunoassay
Summary
Dit protocol beschrijft een meerkleurige immunofluorescentietechniek voor het evalueren van het rattenmodel van allergische rhinitis.
Abstract
Allergische rhinitis (AR) is een chronische, niet-infectieuze ontstekingsziekte van het neusslijmvlies, voornamelijk gemedieerd door specifiek immunoglobuline E (IgE), die ongeveer 10%-20% van de wereldbevolking treft. Hoewel immunofluorescentie (IF)-kleuring lange tijd een standaardtechniek is geweest voor het detecteren van ziektespecifieke eiwitexpressie, zijn conventionele IF-technieken beperkt in hun vermogen om de expressieniveaus van drie of meer eiwitten in hetzelfde monster te detecteren. Daarom zijn er de afgelopen jaren meerkleurige IF-technieken ontwikkeld, die het mogelijk maken om meerdere doelen in cellen of weefsels tegelijkertijd te labelen.
Dit protocol biedt een uitgebreid overzicht van het proces voor het opstellen van een rattenmodel van AR, het verkrijgen van neusslijmvliesmonsters en de technische procedures voor meerkleurige immunofluorescentie. Alle ratten in de AR-groep vertoonden typische symptomen zoals niezen, een loopneus en een jeukende neus, waarbij gedragsobservaties ≥5 punten scoorden. Hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring onthulden een verhoogd aantal ontstekingscellen en verstoorde de integriteit van het neusslijmvlies in de AR-groep. Meerkleurige immunofluorescentie (mIF) vertoonde een verhoogde expressie van RORγt en TICAM-1, terwijl de expressie van Foxp3 afnam in het neusslijmvliesweefsel van AR-ratten.
Introduction
Allergische rhinitis (AR) is een chronische, niet-infectieuze ontstekingsziekte van het neusslijmvlies die voornamelijk wordt gemedieerd door specifiek immunoglobuline E (IgE)1,2. Het wordt gekenmerkt door symptomen zoals niezen, een loopneus, verstopte neus en jeuk aan de neus. Met industrialisatie en verstedelijking neemt de prevalentie van AR geleidelijk toe, wat ongeveer 10%-20% van de wereldbevolkingtreft1. De immunofluorescentie (IF)-techniek is een fluorescerende kleuringsmethode die gebruik maakt van een antilichaam-antigeenbindingsreactie. Het kan worden gebruikt om de distributie- en expressieniveaus van specifieke eiwitten in biologische weefsels of cellen te detecteren en te kwantificeren. In AR-onderzoek kan IF tegelijkertijd meerdere doelen detecteren, waaronder AR-gerelateerde cytokines, ontstekingscellen, receptoren en meer, waardoor de verkenning van AR-pathogenese en de effecten van geneesmiddelen 3,4,5,6 wordt vergemakkelijkt.
Het meerkleurige immunofluorescentiekleuringsproces (mIF) lijkt sterk op het traditionele IF, met de toevoeging van een antilichaamelutiestap tijdens elke kleuringsronde. Deze modificatie maakt de gelijktijdige detectie van meerdere biomarkers op dezelfde weefselsectie mogelijk door middel van sequentiële enkelvoudige labeling en meerdere rondes van herkleuring. mIF is gebaseerd op tyramidesignaalversterking (TSA), waardoor herhaalde cycli van TSA-fluorescerende kleuring en het gebruik van microgolfverwarming mogelijk zijn om antilichamen te verwijderen met behoud van fluorescerende signalen 7,8. In vergelijking met conventionele IF biedt mIF verschillende voordelen: (1) het kan zwak tot expressie gebrachte antigenen detecteren die moeilijk te identificeren zijn met conventionele IF 9,10; (2) het zorgt voor hoogwaardige kleuring met een verbeterde signaal-ruisverhouding; (3) het maakt de kwantificering mogelijk van weefselspecifieke structuren en interessegebieden11; (4) multiplexing van meerdere routes maakt efficiënt gebruik van weefsels en behoudt beperkte pathologische middelen12; (5) multiparameteranalyse door middel van mIF biedt diepere inzichten in weefsels en legt verborgen biologische informatie bloot13.
Over het algemeen maakt mIF de observatie van verschillende antigeenexpressies en -verdelingen binnen hetzelfde monster mogelijk, wat de studie van doeleiwitten vergemakkelijkt. In de toekomst zullen onderzoekers die de expressie en distributie van meerdere doeleiwitten willen begrijpen, deze techniek een waardevolle keuze vinden. Deze studie demonstreert de toepassing van mIF voor het kleuren van neusslijmvliesmonsters van ratten met AR en evalueert de opstelling van een rattenmodel van AR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Allergische rhinitis (AR) is een niet-infectieuze ontstekingsziekte van het neusslijmvlies als gevolg van een combinatie van omgevings- en genetische factoren. Het is een wereldwijd gezondheidsprobleem geworden, dat de werkefficiëntie beïnvloedt, de kwaliteit van leven vermindert, de slaap en de cognitieve functie aantast en prikkelbaarheid en vermoeidheid veroorzaakt. AR treft 10%-20% van de wereldbevolking¹ en brengt aanzienlijke economische kosten met zich mee, met jaarlijkse verliezen tot 30-50 miljard euro in de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2021YJ0175).
Materials
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
Referências
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Pesquisa do Câncer. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Pesquisa do Câncer. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue – a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature reviews. 6 (1), 95 (2020).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Pesquisa do Câncer. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Pesquisa do Câncer. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
