Este protocolo descreve uma técnica de imunofluorescência multicolor para avaliação do modelo de rinite alérgica em ratos.
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E específica (IgE), afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial. Enquanto a coloração por imunofluorescência (IF) tem sido uma técnica padrão para detectar a expressão de proteínas doença-específicas, as técnicas convencionais de FI são limitadas em sua capacidade de detectar os níveis de expressão de três ou mais proteínas na mesma amostra. Consequentemente, técnicas de FI multicolorido têm sido desenvolvidas nos últimos anos, que permitem a marcação simultânea de múltiplos alvos em células ou tecidos.
Este protocolo fornece uma visão abrangente do processo para o estabelecimento de um modelo de RA em ratos, obtenção de amostras de mucosa nasal e procedimentos técnicos para imunofluorescência multicolorida. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz, com observações comportamentais pontuando ≥5 pontos. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou aumento da contagem de células inflamatórias e integridade da mucosa nasal no grupo RA. A imunofluorescência multicolor (mIF) demonstrou aumento da expressão de RORγt e TICAM-1, enquanto a expressão de Foxp3 diminuiu no tecido da mucosa nasal de ratos RA.
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E (IgE) específica1,2. É caracterizada por sintomas como espirros, coriza, congestão nasal e prurido nasal. Com a industrialização e urbanização, a prevalência da RA vem aumentando gradativamente, afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial1. A técnica de imunofluorescência (IF) é um método de coloração fluorescente que utiliza uma reação de ligação anticorpo-antígeno. Pode ser empregado para detectar e quantificar os níveis de distribuição e expressão de proteínas específicas em tecidos biológicos ou células. Na pesquisa de RA, o FI pode detectar simultaneamente múltiplos alvos, incluindo citocinas relacionadas à RA, células inflamatórias, receptores e muito mais, facilitando a exploração da patogênese da RA e dos efeitos de drogas 3,4,5,6.
O processo de coloração por imunofluorescência multicolor (mIF) se assemelha muito ao FI tradicional, com a adição de uma etapa de eluição de anticorpos durante cada rodada de coloração. Essa modificação permite a detecção simultânea de múltiplos biomarcadores na mesma seção de tecido por meio de marcação única sequencial e várias rodadas de recoloração. O mIF é baseado na amplificação do sinal da tiramida (TSA), permitindo ciclos repetidos de coloração fluorescente de TSA e o uso de aquecimento por micro-ondas para remover anticorpos enquanto retém sinais fluorescentes 7,8. Em comparação com o FI convencional, o mIF oferece várias vantagens: (1) pode detectar antígenos fracamente expressos que são difíceis de identificar com o IF convencional 9,10; (2) proporciona coloração de alta qualidade com melhor relação sinal-ruído; (3) permite quantificar estruturas tecido-específicas e regiões de interesse11; (4) a multiplexação de múltiplas vias utiliza tecidos de forma eficiente e conserva recursos patológicos limitados12; (5) a análise multiparamétrica por meio do mIF oferece informações mais profundas sobre os tecidos, revelando informações biológicas ocultas13.
De modo geral, o mIF permite a observação de diferentes expressões e distribuições de antígenos dentro de uma mesma amostra, facilitando o estudo das proteínas-alvo. No futuro, pesquisadores que buscam entender a expressão e distribuição de múltiplas proteínas-alvo encontrarão essa técnica como uma escolha valiosa. Este estudo demonstra a aplicação do mIF na coloração de amostras de mucosa nasal de ratos com RA e avalia o estabelecimento de um modelo de RA em ratos.
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória não infecciosa da mucosa nasal resultante de uma combinação de fatores ambientais e genéticos. Tornou-se um problema de saúde global, impactando a eficiência do trabalho, diminuindo a qualidade de vida, prejudicando o sono, a função cognitiva e causando irritabilidade e fadiga. A RA afeta 10%-20% da população mundial¹ e acarreta custos econômicos substanciais, causando perdas anuais de até 30-50 bilhões de euros nos países da UE18…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2021YJ0175).
Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
Goat serum | Biosharp | BL210A | |
H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX 2023-0100 | |
TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |