Optisk clearing og merking for lysarkfluorescensmikroskopi i storskala menneskelig hjerneavbildning
Summary
Den nåværende protokollen gir en trinnvis prosedyre for rask og samtidig optisk clearing, muti-round merking og 3D volumetrisk rekonstruksjon av titalls postmortem menneskelige hjerneseksjoner ved å kombinere (SWITCH – H 2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) KORT vevstransformasjonsteknikk med lysarkfluorescensmikroskopiavbildning i en rutinemessig høy gjennomstrømningsprotokoll.
Abstract
Til tross for de mange ryddeteknikkene som dukket opp i det siste tiåret, er behandling av menneskelige hjerner post mortem fortsatt en utfordrende oppgave på grunn av dens dimensjoner og kompleksitet, noe som gjør avbildning med mikrometeroppløsning spesielt vanskelig. Denne artikkelen presenterer en protokoll for å utføre rekonstruksjon av volumetriske deler av den menneskelige hjerne ved samtidig å behandle titalls seksjoner med SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) vevstransformasjonsprotokoll, som muliggjør clearing, merking og sekvensiell avbildning av prøvene med lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM). SHORT gir rask vevsrydding og homogen multimerking av tykke skiver med flere nevrale markører, noe som gjør det mulig å identifisere forskjellige nevronale subpopulasjoner i både hvit og grå substans. Etter rydding avbildes skivene via LSFM med mikrometeroppløsning og i flere kanaler samtidig for en rask 3D-rekonstruksjon. Ved å kombinere SHORT med LSFM-analyse innenfor en rutinemessig høy gjennomstrømningsprotokoll, er det mulig å oppnå 3D-cytoarkitekturrekonstruksjon av store volumetriske områder med høy oppløsning på kort tid, og dermed muliggjøre omfattende strukturell karakterisering av den menneskelige hjerne.
Introduction
Analyse av 3D-molekylær organisering og cytoarkitektur av store volumer av den menneskelige hjerne krever optisk gjennomsiktighet av prøver, oppnådd gjennom protokoller med omfattende behandlingstid. Optiske clearingteknikker ble utviklet for å minimere heterogenitet i brytningsindeks (RI) i vevet, og dermed redusere lysspredning og øke lyspenetrasjonsdybden for høyoppløselig avbildning 1,2,3,4,5. Nåværende fremskritt innen clearing og dype vevsmerkingsmetoder tillater volumetrisk avbildning av intakte gnagerorganer og embryoer ved å utnytte banebrytende mikroskopiteknikker 6,7,8,9,10,11,12.
Imidlertid representerer volumetrisk 3D-rekonstruksjon av store områder av den menneskelige hjernen post mortem fortsatt en utfordrende oppgave sammenlignet med modellorganismer. Den komplekse biologiske sammensetningen og de variable postmortemfikserings- og lagringsforholdene kan kompromittere vevets clearingeffektivitet, antistoffpenetrasjonsdybden og epitopgjenkjenningen 13,14,15,16,17,18,19. Videre er mekanisk vevsseksjonering og påfølgende rydding og merking av hvert stykke fortsatt nødvendig for å oppnå en effektiv rydding og ensartet merking av store menneskelige hjerneområder, noe som resulterer i lange behandlingstider og behov for sofistikert tilpasset utstyr, sammenlignet med modellorganismer 15,20,21,22.
SWITCH – H 2O2 – antigen Retrieval –TDE (SHORT) vevstransformasjonsteknikk er utviklet spesielt for å analysere store mengder av den menneskelige hjerne18,23. Denne metoden benytter vevsstrukturell bevaring av SWITCH-protokollen11 og høye konsentrasjoner av peroksidhydrogen for å redusere vevsautofluorescens, i kombinasjon med epitoprestaurering. SHORT tillater jevn farging av menneskelige hjerneskiver med markører for forskjellige nevronale subtyper, gliaceller, vaskulatur og myeliniserte fibre18,24. Resultatene er kompatible med analysen av både proteiner med lav og høy tetthet. De resulterende høye gjennomsiktighetsnivåene og ensartet merking muliggjør volumetrisk rekonstruksjon av tykke skiver med fluorescensmikroskopi, spesielt for rask oppkjøp lysarkapparat kan brukes 18,24,25,26,27.
I dette arbeidet beskriver vi hvordan SHORT vevstransformasjonsteknikken kan brukes til samtidig clearing og multi-round merking av titalls formalinfikserte menneskelige hjerneseksjoner. Fire forskjellige fluorescerende markører kan brukes sammen, noe som fører til identifisering av forskjellige cellulære underpopulasjoner. Etter clearing kan høyoppløselig volumetrisk avbildning utføres med fluorescensmikroskopi. Her brukte vi en skreddersydd invertert LSFM 18,24,25,26,27, som muliggjør rask optisk seksjonering av prøven og rask innsamling av flere kanaler parallelt. Med denne rutinemessig høye gjennomstrømningsprotokollen er det mulig å oppnå en omfattende cellulær og strukturell karakterisering med en subcellulær oppløsning av store områder av den menneskelige hjerne som allerede demonstrert i kartleggingen av et helt Brocas område23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Høyoppløselig avbildning og 3D-rekonstruksjon av store menneskelige hjerneområder krever mekanisk vevsseksjonering etterfulgt av optisk clearing og immunmerking av enkeltskiver. Protokollen som presenteres her beskriver hvordan SHORT vevstransformasjonsmetoden kan brukes til rask og samtidig prosessering av flere tykke seksjoner av menneskelig hjerne for 3D-hjernerekonstruksjon med en subcellulær oppløsning med LSFM.
I motsetning til andre tilnærminger, med SHORT-metoden, krever ikke ryd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, AA Martinos Center for Biomedical Imaging, Institutt for radiologi, for å gi de menneskelige hjerneprøvene analysert i denne studien. Dette prosjektet mottok finansiering fra EUs rammeprogram for forskning og innovasjon i Horizon 2020 under tilskuddsavtale nr. 654148 (Laserlab-Europe), fra EUs Horizon 2020-rammeprogram for forskning og innovasjon under den spesifikke tilskuddsavtalen nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) og nr. 945539 (Human Brain Project SGA3), fra General Hospital Corporation Center of National Institutes of Health under tildelingsnummer U01 MH117023, og fra det italienske utdanningsdepartementet innenfor rammen av Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI forskningsinfrastruktur). Endelig ble denne undersøkelsen utført med bidrag fra “Fondazione CR Firenze.” Innholdet i dette arbeidet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Figur 1 ble laget med BioRender.com.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
Referências
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca’s area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
