Optisk rensning och märkning för fluorescensmikroskopi i storskalig mänsklig hjärnavbildning
Summary
Det nuvarande protokollet tillhandahåller en steg-för-steg-procedur för snabb och samtidig optisk clearing, muti-round-märkning och 3D-volymetrisk rekonstruktion av tiotals postmortem-sektioner av mänsklig hjärna genom att kombinera (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-tiodietanol [TDE]) kortvävnadstransformationsteknik med fluorescensmikroskopiavbildning i lätta ark i ett rutinmässigt protokoll med hög genomströmning.
Abstract
Trots de många clearingtekniker som dykt upp under det senaste decenniet är bearbetning av mänskliga hjärnor efter döden fortfarande en utmanande uppgift på grund av dess dimensioner och komplexitet, vilket gör avbildning med mikrometerupplösning särskilt svår. Denna artikel presenterar ett protokoll för att utföra rekonstruktionen av volymetriska delar av den mänskliga hjärnan genom att samtidigt bearbeta tiotals sektioner med SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-tiodietanol [TDE]) vävnadstransformationsprotokoll, vilket möjliggör clearing, märkning och sekventiell avbildning av proverna med light-sheet fluorescence mikroskopi (LSFM). SHORT ger snabb vävnadsrensning och homogen multimärkning av tjocka skivor med flera neuronala markörer, vilket möjliggör identifiering av olika neuronala subpopulationer i både vit och grå substans. Efter rensning avbildas skivorna via LSFM med mikrometerupplösning och i flera kanaler samtidigt för en snabb 3D-rekonstruktion. Genom att kombinera SHORT med LSFM-analys inom ett rutinmässigt protokoll med hög genomströmning är det möjligt att erhålla 3D-cytoarkitekturrekonstruktion av stora volymetriska områden med hög upplösning på kort tid, vilket möjliggör omfattande strukturell karakterisering av den mänskliga hjärnan.
Introduction
Att analysera den molekylära 3D-organisationen och cytoarkitekturen hos stora volymer av den mänskliga hjärnan kräver optisk transparens av prover, vilket uppnås genom protokoll med lång bearbetningstid. Optiska rensningstekniker utvecklades för att minimera heterogeniteten i brytningsindex (RI) i vävnaderna, vilket minskar ljusspridningen och ökar ljusgenomträngningsdjupet för högupplöst avbildning 1,2,3,4,5. Nuvarande framsteg inom clearing- och djupvävnadsmärkningsmetoder möjliggör volymetrisk avbildning av intakta gnagarorgan och embryon genom att utnyttja banbrytande mikroskopitekniker 6,7,8,9,10,11,12.
Volymetrisk 3D-rekonstruktion av stora delar av den mänskliga hjärnan efter döden är dock fortfarande en utmanande uppgift jämfört med modellorganismer. Den komplexa biologiska sammansättningen och de varierande fixerings- och lagringsförhållandena efter döden kan äventyra vävnadsrensningseffektiviteten, antikroppspenetrationsdjupet och epitopigenkänningen 13,14,15,16,17,18,19. Dessutom krävs fortfarande mekanisk vävnadssnittning och efterföljande rensning och märkning av varje skiva för att uppnå en effektiv rensning och enhetlig märkning av stora mänskliga hjärnområden, vilket resulterar i långa bearbetningstider och behovet av sofistikerad anpassad utrustning, jämfört med modellorganismer 15,20,21,22.
Vävnadstransformationstekniken SWITCH – H2O2 – antigen Retrieval –TDE (SHORT) har utvecklats specifikt för att analysera stora volymer av den mänskliga hjärnan18,23. Denna metod använder vävnadsstrukturellt bevarande av SWITCH-protokoll11 och höga koncentrationer av peroxidväte för att minska vävnadens autofluorescens, i kombination med epitoprestaurering. SHORT möjliggör enhetlig färgning av mänskliga hjärnskivor med markörer för olika neuronala subtyper, gliaceller, kärl och myeliniserade fibrer18,24. Dess resultat är kompatibla med analys av både låg- och högdensitetsproteiner. De resulterande höga transparensnivåerna och enhetlig märkning möjliggör volymetrisk rekonstruktion av tjocka skivor med fluorescensmikroskopi, i synnerhet för snabb insamling kan lätta arkapparater användas 18,24,25,26,27.
I detta arbete beskriver vi hur vävnadstransformationstekniken SHORT kan användas för samtidig rensning och multi-round märkning av tiotals formalinfixerade mänskliga hjärnsnitt. Fyra olika fluorescerande markörer kan användas tillsammans, vilket leder till identifiering av olika cellulära subpopulationer. Efter rensning kan högupplöst volymetrisk avbildning utföras med fluorescensmikroskopi. Här använde vi en skräddarsydd inverterad LSFM 18,24,25,26,27, som möjliggör snabb optisk snittning av provet och snabb insamling av flera kanaler parallellt. Med detta protokoll med rutinmässig hög genomströmning är det möjligt att få en omfattande cellulär och strukturell karakterisering med en subcellulär upplösning av stora områden av den mänskliga hjärnan, vilket redan visats i kartläggningen av ett helt Brocas område23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Högupplöst avbildning och 3D-rekonstruktion av stora mänskliga hjärnområden kräver mekanisk vävnadssnittning följt av optisk rensning och immunmärkning av enskilda skivor. Protokollet som presenteras här beskriver hur SHORT-vävnadstransformationsmetoden kan användas för snabb och samtidig bearbetning av flera tjocka snitt i den mänskliga hjärnan för 3D-hjärnrekonstruktion med en subcellulär upplösning med LSFM.
Till skillnad från andra tillvägagångssätt, med SHORT-metode…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, AA Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, för att ha tillhandahållit de mänskliga hjärnproverna som analyserats i denna studie. Detta projekt fick finansiering från EU:s ramprogram för forskning och innovation Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 654148 (Laserlab-Europe), från EU:s Horizon 2020 ramprogram för forskning och innovation enligt det specifika bidragsavtalet nr 785907 (Human Brain Project SGA2) och nr 945539 (Human Brain Project SGA3), från General Hospital Corporation Center of the National Institutes of Health under tilldelningsnummer U01 MH117023, och från det italienska utbildningsministeriet inom ramen för Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI:s forskningsinfrastruktur). Slutligen utfördes denna forskning med bidrag från “Fondazione CR Firenze”. Innehållet i detta arbete är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. Figur 1 skapades med BioRender.com.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
Referências
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca’s area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
