Schnelle und effiziente Anreicherung von Mikroglia des Rückenmarks der Maus
Summary
Mikroglia gelten als einige der vielseitigsten Zellen des Körpers, die zur morphologischen und funktionellen Anpassung fähig sind. Ihre Heterogenität und Multifunktionalität ermöglicht die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und ist gleichzeitig mit verschiedenen neurologischen Pathologien verbunden. Hier wird eine Technik zur Reinigung von Rückenmarksmikroglia beschrieben.
Abstract
Die Wirbelsäule definiert ein Wirbeltier und formt den Wirbelkanal, einen Hohlraum, der das Rückenmark umschließt und schützt. Die richtige Entwicklung und Funktion des zentralen Nervensystems von Säugetieren hängt maßgeblich von der Aktivität der ansässigen Makrophagen ab, die als Mikroglia bekannt sind. Mikroglia weisen Heterogenität und Multifunktionalität auf, was eine unterschiedliche Genexpression und ein unterschiedliches Verhalten im Rückenmark und im Gehirn ermöglicht. Zahlreiche Studien haben die Funktion der zerebralen Mikroglia untersucht und die Reinigungsmethoden ausführlich beschrieben. Für die Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark bei Mäusen fehlt jedoch eine umfassende Beschreibung. Im Gegensatz dazu fehlt der Verwendung einer hochgereinigten Kollagenase im Gegensatz zu einem unraffinierten Extrakt die Berichterstattung im Gewebe des zentralen Nervensystems. In dieser Studie wurden die Wirbelsäule und das Rückenmark von 8-10 Wochen alten C57BL/6-Mäusen herausgeschnitten. Bei der anschließenden Verdauung wurde eine hochgereinigte Kollagenase verwendet, und bei der Mikrogliareinigung wurde ein Dichtegradient verwendet. Die Zellen wurden für die Durchflusszytometrie gefärbt, wobei die Lebensfähigkeit und Reinheit durch CD11b- und CD45-Färbung beurteilt wurde. Die Ergebnisse ergaben eine durchschnittliche Viabilität von 80 % und eine mittlere Reinheit von 95 %. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Manipulation der Mikroglia der Maus eine Verdauung mit einer hochgereinigten Kollagenase beinhaltete, gefolgt von einem Dichtegradienten. Dieser Ansatz erzeugte effektiv beträchtliche Populationen von Rückenmark-Mikroglia.
Introduction
Das bestimmende Merkmal von Wirbeltieren ist die Wirbelsäule oder Wirbelsäule, in der der Notochord durch eine Abfolge segmentierter Knochen ersetzt wurde, die als Wirbel bezeichnet werden und durch Bandscheiben getrennt sind. Diese Abfolge von knöchernem Material formt den Spinalkanal, einen Hohlraum, der das Rückenmark umschließt und schützt1. Bei der Gattung Rodentia besteht die Wirbelsäule in der Regel aus sieben Halswirbeln, dreizehn Brustwirbeln, sechs Lendenwirbeln und einer variablen Anzahl von Schwanzwirbeln 2,3. Die Länge des Rückenmarks ähnelt der der Wirbelsäule, und das terminale Filumum ist eine nicht-nervöse Struktur, die das Rückenmark im Kreuzbein verankert. Zusätzlich treten Nervenfasern durch das Foramen intervertebralisaus 1.
Die Entwicklung und ordnungsgemäße Funktion des zentralen Nervensystems bei Säugetieren hängt entscheidend von der Aktivität der im Nervensystem ansässigen Makrophagen, den sogenannten Mikroglia4, ab. Obwohl Mikroglia ursprünglich als hirnresidente Phagozyten beschrieben wurden, haben neuere Forschungen diesen Zellen viele dynamische Funktionen zugeschrieben 5,6. Die Größe von Mikroglia reicht von 7 bis 10 μm in der Homöostase; Sie gelten als eine der vielseitigsten Zellen des Körpers und können sich morphologisch und funktionell an ihre sich ständig verändernde Umgebung anpassen7. Diese Zellen weisen sowohl im embryonalen als auch im adulten Stadium eine hohe Heterogenität auf8,9, während sie im adulten Stadium auch eine komplexe funktionelle Heterogenität aufweisen, die auf ihrem raumzeitlichen Kontext beruht10. Die Heterogenität und die vielfältigen Funktionen von Mikroglia ermöglichen eine unterschiedliche Genexpression und ein unterschiedliches Verhalten im Rückenmark und im Gehirn. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von CD11b, CD45, CD86 und CCR9 im Rückenmark höher ist als im Gehirn 8,9.
Es existieren mehrere Protokolle für die Isolierung zerebraler Mikroglia11,12; Für Rückenmarksmikroglia existieren jedoch nur wenige13,14. Die Optimierung einer Methode zur Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark erleichtert die Entwicklung mehrerer Studien, die sich auf die Entdeckung der Mikroglia-Physiologie konzentrieren. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine einfache und hochgradig reproduzierbare Extraktion des Rückenmarks der Maus und die Reinigung von Mikroglia zu beschreiben (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die Untersuchung von Mikroglia wurden aufgrund ihrer Bedeutung für die Homöostase des Gehirns zahlreiche Protokolle entwickelt. Bei diesen Methoden werden Mikroglia typischerweise aus den Großhirnhemisphären von embryonalen oder neonatalen Ratten und Mäusen gewonnen17. Eine begrenzte Anzahl von Studien befasste sich mit der Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark erwachsener Mäuse13,14. Diese Techniken beinhalten eine enzyma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Council of Science and Technology (CONACYT) unterstützt (702361). Die Autoren würdigen das Ph.D.-Programm in Biological Chemical Sciences der National School of Biological Sciences des National Polytechnic Institute.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
Referências
- Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
