Enriquecimento rápido e eficiente da microglia medular de camundongos

Summary

As microglias são consideradas algumas das células mais versáteis do organismo, capazes de adaptação morfológica e funcional. Sua heterogeneidade e multifuncionalidade possibilitam a manutenção da homeostase cerebral, além de estarem ligadas a diversas patologias neurológicas. Aqui, uma técnica para purificar a microglia da medula espinhal é descrita.

Abstract

A coluna vertebral define um vertebrado e molda o canal vertebral, uma cavidade que encerra e protege a medula espinhal. O desenvolvimento e a função adequados do sistema nervoso central de mamíferos dependem significativamente da atividade de macrófagos residentes conhecidos como microglia. A microglia apresenta heterogeneidade e multifuncionalidade, permitindo expressão gênica e comportamento distintos dentro da medula espinhal e do cérebro. Numerosos estudos têm explorado a função da microglia cerebral, detalhando extensivamente os métodos de purificação. No entanto, a purificação da micróglia da medula espinhal em camundongos carece de uma descrição abrangente. Em contraste, a utilização de uma colagenase altamente purificada, em oposição a um extrato não refinado, carece de relatos nos tecidos do sistema nervoso central. Neste estudo, a coluna vertebral e a medula espinhal foram excisadas de camundongos C57BL/6 com 8-10 semanas de idade. A digestão subsequente empregou uma colagenase altamente purificada, e a purificação da micróglia utilizou um gradiente de densidade. As células foram submetidas à coloração por citometria de fluxo, avaliando-se viabilidade e pureza através das colorações CD11b e CD45. Os resultados mostraram viabilidade média de 80% e pureza média de 95%. Em conclusão, a manipulação da micróglia de camundongos envolveu digestão com colagenase altamente purificada, seguida de gradiente de densidade. Essa abordagem efetivamente produziu populações substanciais de microglia medular.

Introduction

A característica definidora dos vertebrados é a coluna vertebral ou coluna vertebral, na qual a notocorda foi substituída por uma sequência de ossos segmentados chamados vértebras, divididos por discos intervertebrais. Essa sucessão de material ósseo forma o canal vertebral, uma cavidade que envolve e protege a medula espinhal¹. No gênero Rodentia, a coluna vertebral é geralmente formada por sete vértebras cervicais, treze vértebras torácicas, seis vértebras lombares e um número variável de vértebras^caudais2,3. O comprimento da medula espinhal é semelhante ao da coluna vertebra....

Protocol

O estudo foi conduzido de acordo com a norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 e o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório. O estudo foi aprovado pelos Comitês de Pesquisa, Ética e Biossegurança do Hospital Infantil do México (HIM/2023/006) e do Comitê de Pesquisa e Bioética do Hospital Geral do México Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Três camundongos C57BL/6 com idades entre 6 e 8 semanas foram obtidos do Hospital Infantil do México, onde foram criados em condições isoladas em racks ventilados, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais.

1. Preparação de materiais e reagentes

Results

Utilizando tecido medular de camundongos, a digestão enzimática foi realizada utilizando uma mistura altamente enriquecida com colagenase e termolisina. O tecido digerido resultante foi submetido à passagem por um filtro de 40 μm para eliminar o material não digerido. As células coletadas foram enriquecidas através de um gradiente de densidade de Percoll, com 90% na porção inferior e 45% na porção superior. As células enriquecidas com microglia dentro da interface foram então coradas com anticorpos CD45 e CD11b e submeti.......

Discussion

Inúmeros protocolos têm sido desenvolvidos para o estudo da micróglia devido à sua importância na homeostase cerebral. Nesses métodos, as microglias são tipicamente originadas dos hemisférios cerebrais de ratos embrionários ou neonatais e camundongos¹⁷. Um número limitado de estudos abordou a purificação da micróglia da medula espinhal de camundongos adultos^13,14. Essas técnicas envolvem digestão enzimática usando colagenase e/ou papaína j.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de coleta de 15 mL	Corning, EUA	430790
Microtubos de 2 mL	Axygen, EUA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, EUA	101302
50 mL	Corning, EUA	430829
etanol
Antibiótico-Antimicótico (penicilina, estreptomicina, anfotericina b)	Gibco, EUA	15240062
Anticorpo CD11b eFluor 450 anti-camundongo	eBioscience, EUA	48-0112
Anticorpo CD45 PerCP anti-camundongo	BioLegend, EUA	103130
Solução salina balanceada (PBS) livre de cálcio - magnésio	Corning, EUA	46-013-CM
Filtro de Células Azuis 40 μ m	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Não Tratados	Corning, EUA	CLS3736
Coverslips
Digital Aquecimento Banho Seco Agitado	Thermo Scientific Digital HS Drybath, EUA	88870001
Pinça de dissecação para microcirurgia	FT por DUMONT
DNase	Roche, EUA	4536282001
Dulbecco´ s Águia Modificada&agudo; s Glicose média-alta (DMEM)	Merck, USA	D6429
Barbeador
FACS tube	Thermo, USA	352058
Soro fetal bovino (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Citômetro de fluxo Cytoflex	Beckman Coulter
Hank' s solução salina balanceada	Merck, EUA	H2387
L-glutamina	Corning, EUA
Liberase TM	Roche, EUA	5401119001
Câmara de Neubauer Câmaras de Contagem	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, EUA	17089101	centrifugação com gradiente de densidade
Solução de poli-L-lisina	Merck, EUA	P8920
Bisturi No. 25	HERGOM, México	H23
Tubos de microcentrífuga Snaplock 2 mL	Axygen, EUA	10011-680
Microscópio estereoscópico	Velab, México	HG927831
Tesoura cirúrgica reta (10 cm)	HERGOM, México
Tesoura reta Vannas	HERGOM, México
Triton X100	Merck, EUA	X100
Mancha azul de tripano 0,4%	Merck, EUA	15250-061
Misturador de vórtice	DLAB, China	8031102000
Kit de Viabilidade Fixável Zombie Aqua	BioLegend, EUA	423102	coloração de corante fluorescente reativo a aminas