Mikroglia regnes som noen av de mest allsidige cellene i kroppen, i stand til morfologisk og funksjonell tilpasning. Deres heterogenitet og multifunksjonalitet muliggjør vedlikehold av hjernens homeostase, samtidig som de er knyttet til ulike nevrologiske patologier. Her beskrives en teknikk for rensing av ryggmargsmikroglia.
Virvelsøylen definerer et virveldyr og former ryggraden, et hulrom som omslutter og beskytter ryggmargen. Riktig utvikling og funksjon av pattedyrs sentralnervesystem er avhengig av aktiviteten til bosatt makrofager kjent som mikroglia. Mikroglia viser heterogenitet og multifunksjonalitet, noe som muliggjør distinkt genuttrykk og oppførsel i ryggmargen og hjernen. Tallrike studier har utforsket cerebral mikroglia-funksjon, og beskriver rensingsmetoder omfattende. Rensingen av mikroglia fra ryggmargen hos mus mangler imidlertid en omfattende beskrivelse. I motsetning til dette mangler bruken av en høyt renset kollagenase, i motsetning til et uraffinert ekstrakt, rapportering i vev i sentralnervesystemet. I denne studien ble virvelsøylen og ryggmargen skåret ut fra 8-10 uker gamle C57BL/6-mus. Påfølgende fordøyelse benyttet en svært renset kollagenase, og mikrogliarensing benyttet en tetthetsgradient. Cellene gjennomgikk farging for flowcytometri, og vurderte levedyktighet og renhet gjennom CD11b- og CD45-farging. Resultatene ga en gjennomsnittlig levedyktighet på 80% og en gjennomsnittlig renhet på 95%. Avslutningsvis involverte manipulering av musemikroglia fordøyelsen med en høyt renset kollagenase, etterfulgt av en tetthetsgradient. Denne tilnærmingen produserte effektivt betydelige ryggmargsmikrogliapopulasjoner.
Den definerende egenskapen til vertebrater er vertebral kolonnen eller ryggraden, hvor notokordet er erstattet av en sekvens av segmenterte bein kalt ryggvirvler, delt med intervertebrale skiver. Denne rekkefølgen av osseous materiale former spinalkanalen, et hulrom som omslutter og beskytter ryggmargen1. I slekten Rodentia er ryggraden vanligvis dannet av syv nakkevirvler, tretten thoraxvirvler, seks lumbale ryggvirvler og et variabelt antall kaudale ryggvirvler 2,3. Lengden på ryggmargen er lik ryggraden, og det terminale filum er en ikke-nervøs struktur som forankrer ryggmargen til sakrummet. I tillegg går nervefibrene ut gjennom det intervertebrale foramen1.
Utviklingen og riktig funksjon av sentralnervesystemet hos pattedyr er kritisk avhengig av aktiviteten til nervesystemets fastboende makrofager, kalt mikroglia4. Selv om mikroglia opprinnelig ble beskrevet som hjernebosatte fagocytter, har nyere forskning tilskrevet mange dynamiske funksjoner til disse cellene 5,6. Microglias størrelse varierer fra 7 til 10 μm i homeostase; De regnes blant de mest allsidige cellene i kroppen og kan tilpasse seg morfologisk og funksjonelt til deres stadig skiftende miljø7. Disse cellene viser høy heterogenitet under både embryonale og voksne stadier8,9, mens de i voksenstadiet også viser kompleks funksjonell heterogenitet basert på deres spatiotemporale kontekst10. Heterogeniteten og flere funksjoner av mikroglia tillater differensielt genuttrykk og oppførsel i ryggmargen og hjernen. Det har vist seg at CD11b, CD45, CD86 og CCR9-uttrykk er høyere i ryggmargen sammenlignet med hjernen 8,9.
Det finnes flere protokoller for isolering av cerebral mikroglia11,12; Imidlertid finnes det bare noen få for ryggmargsmikroglia13,14. Optimalisering av en metode for rensing av mikroglia fra ryggmargen letter utviklingen av flere studier fokusert på å oppdage mikrogliafysiologi. Denne protokollen tar sikte på å beskrive en enkel og svært reproduserbar ekstraksjon av musens ryggmarg og rensing av mikroglia (figur 1).
Tallrike protokoller er utviklet for studier av mikroglia på grunn av deres betydning i hjernens homeostase. I disse metodene kommer mikroglia vanligvis fra hjernehalvdelene hos embryonale eller neonatale rotter og mus17. Et begrenset antall studier har adressert rensing av mikroglia fra ryggmargen hos voksne mus13,14. Disse teknikkene involverer enzymatisk fordøyelse ved bruk av kollagenase og/eller papain sammen med DNAse, ofte kombine…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av stipend gitt av National Council of Science and Technology (CONACYT) (702361). Forfatterne anerkjenner Ph.D. program i biologiske kjemiske vitenskaper ved National School of Biological Sciences ved National Polytechnic Institute.
15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
70% ethanol | |||
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
Coverslips | |||
Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
Electric shaver | |||
FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
Pentobarbital | |||
Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |