Enriquecimiento rápido y eficiente de la microglía de la médula espinal de ratón
Summary
La microglía está considerada como una de las células más versátiles del cuerpo, capaz de adaptarse morfológica y funcionalmente. Su heterogeneidad y multifuncionalidad permiten el mantenimiento de la homeostasis cerebral, a la vez que se relacionan con diversas patologías neurológicas. Aquí se describe una técnica para purificar la microglía de la médula espinal.
Abstract
La columna vertebral define a un vertebrado y da forma al canal espinal, una cavidad que encierra y protege la médula espinal. El desarrollo y la función adecuados del sistema nervioso central de los mamíferos dependen en gran medida de la actividad de los macrófagos residentes conocidos como microglía. La microglía muestra heterogeneidad y multifuncionalidad, lo que permite una expresión génica y un comportamiento distintos dentro de la médula espinal y el cerebro. Numerosos estudios han explorado la función de la microglía cerebral, detallando ampliamente los métodos de purificación. Sin embargo, la purificación de la microglía de la médula espinal en ratones carece de una descripción completa. Por el contrario, la utilización de una colagenasa altamente purificada, a diferencia de un extracto sin refinar, carece de información dentro de los tejidos del sistema nervioso central. En este estudio, se extirpó la columna vertebral y la médula espinal de ratones C57BL/6 de 8-10 semanas de edad. La digestión posterior empleó una colagenasa altamente purificada, y la purificación de la microglía utilizó un gradiente de densidad. Las células se sometieron a tinción para citometría de flujo, evaluando la viabilidad y pureza a través de la tinción de CD11b y CD45. Los resultados arrojaron una viabilidad media del 80% y una pureza media del 95%. En conclusión, la manipulación de la microglía de ratón implicó la digestión con una colagenasa altamente purificada, seguida de un gradiente de densidad. Este enfoque produjo efectivamente poblaciones sustanciales de microglía de la médula espinal.
Introduction
La característica definitoria de los vertebrados es la columna vertebral o columna vertebral, en la que la notocorda ha sido reemplazada por una secuencia de huesos segmentados llamados vértebras, divididos por discos intervertebrales. Esta sucesión de material óseo da forma al canal espinal, una cavidad que encierra y protege la médula espinal1. En el género Rodentia, la columna vertebral suele estar formada por siete vértebras cervicales, trece vértebras torácicas, seis vértebras lumbares y un número variable de vértebras caudales 2,3. La longitud de la médula espinal es similar a la de la columna vertebral, y el filum terminal es una estructura no nerviosa que ancla la médula espinal al sacro. Además, las fibras nerviosas salen a través del agujero intervertebral1.
El desarrollo y el funcionamiento adecuado del sistema nervioso central en los mamíferos dependen críticamente de la actividad de los macrófagos residentes del sistema nervioso, llamados microglía4. A pesar de que las microglías fueron descritas inicialmente como fagocitos residentes en el cerebro, investigaciones recientes han atribuido muchas funciones dinámicas a estas células 5,6. El tamaño de la microglía varía de 7 a 10 μm en homeostasis; Se consideran entre las células más versátiles del cuerpo y pueden adaptarse morfológica y funcionalmente a su entorno en constante cambio7. Estas células exhiben una alta heterogeneidad tanto en la etapa embrionaria como en la adulta8,9, mientras que en la etapa adulta también presentan una heterogeneidad funcional compleja basada en su contexto espacio-temporal10. La heterogeneidad y las múltiples funciones de la microglía permiten la expresión génica diferencial y el comportamiento en la médula espinal y el cerebro. Se ha demostrado que la expresión de CD11b, CD45, CD86 y CCR9 es mayor en la médula espinal en comparación con el cerebro 8,9.
Existen múltiples protocolos para el aislamiento de microglía cerebral11,12; sin embargo, solo existen unos pocos para la microglía de la médula espinal13,14. La optimización de un método para purificar la microglía de la médula espinal facilita el desarrollo de múltiples estudios centrados en el descubrimiento de la fisiología de la microglía. Este protocolo tiene como objetivo describir una extracción simple y altamente reproducible de la médula espinal del ratón y la purificación de la microglía (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han desarrollado numerosos protocolos para el estudio de la microglía debido a su importancia en la homeostasis cerebral. En estos métodos, la microglía se obtiene típicamente de los hemisferios cerebrales de ratas y ratones embrionarios o neonatos17. Un número limitado de estudios han abordado la purificación de la microglía de la médula espinal de ratones adultos13,14. Estas técnicas implican la digestión enzimática utiliza…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las becas otorgadas por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) (702361). Los autores reconocen el programa de doctorado en Ciencias Químicas Biológicas de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
Referências
- Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
