En effektiv og hurtig metode til mærkning og analyse af museglomeruli

Summary

Denne undersøgelse præsenterer et brugervenligt, komplet og simpelt sæt metoder til at mærke og analysere glomeruli fra CUBIC-ryddede musenyrer. Data såsom glomerulus antal og volumen kan opnås let og pålideligt ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC)-Dextran, lysark fluorescens mikroskopi (LSFM), eller fælles konfokal mikroskopi og software såsom Imaris.

Abstract

Glomeruli er grundlæggende enheder i nyrerne; Derfor er undersøgelse af glomeruli afgørende for forståelsen af nyrefunktion og patologi. Biologisk billeddannelse giver intuitiv information; Det er således af stor betydning at mærke og observere glomeruli. Imidlertid kræver glomeruli-observationsmetoderne, der i øjeblikket er i brug, komplicerede operationer, og resultaterne kan miste etiketdetaljer eller tredimensionel (3D) information. Den klare, uhindrede hjernebilleddannelsescocktails og beregningsanalyse (CUBIC) vævsrensningsteknologi er blevet brugt i vid udstrækning i nyreforskning, hvilket giver mulighed for mere nøjagtig detektion og dybere detektionsdybde. Vi fandt ud af, at museglomeruli hurtigt og effektivt kan mærkes ved haleveneinjektion af FITC-Dextran med medium molekylvægt efterfulgt af CUBIC clearing-metoden. Den ryddede musenyre kunne scannes af et lysarkmikroskop (eller et konfokalmikroskop, når det skæres) for at opnå tredimensionelle billedstakke af alle glomeruli i hele nyrerne. Behandlet med passende software kunne glomeruli-signalerne let digitaliseres og analyseres yderligere for at måle antallet, volumenet og frekvensen af glomeruli.

Introduction

Antallet og mængden af glomeruli er meget vigtigt for diagnosticering og behandling af forskellige nyresygdomme 1,2,3,4,5. Den gyldne standard for glomeruli nummer estimering er den fysiske dissektor / fraktionator kombination. Denne metode kræver dog specielle reagenser og udstyr, hvilket gør den langsom og dyr 6,7,8,9. Biopsi giver et væld af oplysninger, men denne metode er naturligvis kun egnet til grove estimater^10,11. Medicinske billeddannelsesteknologier, herunder magnetisk resonansbilleddannelse (MR), computertomografi (CT) og røntgen, anvendes også i vid udstrækning i glomerulær detektion 12,13,14,15, men sådanne teknologier kræver omfangsrige instrumenter. Nye metoder, såsom matrixassisteret laserdesorption / ionisering (MALDI) billeddannelse^{massespektrometer 16} eller tyk og tynd sektion metode¹⁷, er også blevet brugt til glomerulær detektion, selvom de forbliver kedelige og besværlige.

Ved hjælp af gennemsigtighedsteknologier er det muligt at observere dybere dybder og opnå rigere og mere komplet information fra tykt væv eller endda hele organer 18,19,20,21,22,23. Derfor er gennemsigtighedsteknologier blevet anvendt i vid udstrækning i nyreforskning²⁴. Observation og påvisning af glomeruli i de ryddede nyrer er også involveret. Imidlertid henviste disse offentliggjorte artikler enten kun kort til glomerulær detektion²⁵ eller brugte vanskelige at opnå mærkningsmetoder såsom transgene dyr²⁶, selvproducerede farvestoffer¹³ eller antistofinkubation med høj koncentration²⁷ til mærkning af glomeruli. Hertil kommer, at selv om undersøgelser havde analyseret glomeruli i ryddede nyrer, var analyserne altid begrænsede¹³ eller baseret på analysealgoritmer etableret af forfatterne selv²⁶.

Vi har tidligere demonstreret en mere bekvem måde at mærke glomeruli hos mus nyrer²⁸. Ved at bruge Imaris fandt vi, at glomerulital, frekvens og volumen hurtigt kunne opnås. Således præsenterer vi her et mere tilgængeligt, omfattende og forenklet sæt metoder til mærkning og analyse af glomeruli hos mus nyrer.

Protocol

Voksne C57BL/6-mus (6 uger, 25-30 g) blev anvendt i dette studie. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med lokale regler for dyrevelfærd og eksperimentel etik. Undersøgelsen blev godkendt af West China Hospital of Sichuan University Biomedical Research Ethics Committee. 1. Glomeruli mærkning og vævsforberedelse Glomeruli mærkningFITC-dextran (10 mg) opløses i 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i forholdet 1:1 (1 mg: 1 ml) for at forberede arbejds…

Representative Results

Denne undersøgelse giver en enkel og effektiv metode til mærkning og analyse af glomeruli hos mus nyrer. Glomeruli (blodkar) kan mærkes godt ved intravaskulært injiceret FITC-Dextran. Efter clearingprocessen blev nyrerne gennemsigtige (figur 1A), og glomeruli kunne tydeligt observeres ved hjælp af lysarkmikroskopi (figur 1B) eller konfokalmikroskopi (figur 1C). Konfokal mikroskopi har en begrænset s…

Discussion

Vævsrensningsteknologier kan klassificeres i 3 eller 4 grupper 29,30,31. Organisk opløsningsmiddelbaseret vævsrensning (f.eks. DISCO og PEGASOS), vandig vævsrensning (f.eks. CUBIC) og hydrogelindlejringsvævsrensning (f.eks. CLARITY) er alle blevet anvendt til nyrerensning 25,26,28,32. CUBIC, som v…

Materials

4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent