Summary

En effektiv og rask metode for merking og analyse av museglomeruli

Published: February 09, 2024
doi:

Summary

Denne studien presenterer et brukervennlig, komplett og enkelt sett med metoder for å merke og analysere glomeruli fra CUBIC-ryddede musenyrer. Data som glomerulusantall og volum kan oppnås enkelt og pålitelig ved hjelp av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-Dextran, lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM), eller vanlig konfokalmikroskopi og programvare som Imaris.

Abstract

Glomeruli er grunnleggende enheter i nyrene; Derfor er studier av glomeruli avgjørende for å forstå nyrefunksjon og patologi. Biologisk avbildning gir intuitiv informasjon; Dermed er det av stor betydning å merke og observere glomeruli. Imidlertid krever glomeruli observasjonsmetoder som er i bruk kompliserte operasjoner, og resultatene kan miste etikettdetaljer eller tredimensjonal (3D) informasjon. Den klare, uhindrede hjerneavbildningscocktailer og beregningsanalyse (CUBIC) vevsfjerningsteknologi har blitt mye brukt i nyreforskning, noe som muliggjør mer nøyaktig deteksjon og dypere deteksjonsdybde. Vi fant at musglomeruli raskt og effektivt kan merkes ved haleveneinjeksjon av middels molekylvekt FITC-Dextran etterfulgt av CUBIC-clearing-metoden. Den ryddede musenyren kunne skannes av et lysarkmikroskop (eller et konfokalmikroskop når det ble skåret) for å oppnå tredimensjonale bildestabler av alle glomeruli i hele nyren. Behandlet med passende programvare, kan glomeruli-signalene enkelt digitaliseres og analyseres videre for å måle antall, volum og frekvens av glomeruli.

Introduction

Antallet og volumet av glomeruli er svært viktig for diagnostisering og behandling av ulike nyresykdommer 1,2,3,4,5. Den gylne standarden for glomeruli tallestimering er den fysiske dissektor / fraksjonator kombinasjonen. Denne metoden krever imidlertid spesielle reagenser og utstyr, noe som gjør det tregt og dyrt 6,7,8,9. Biopsi gir et vell av informasjon, men åpenbart er denne metoden bare egnet for grove estimater10,11. Medisinsk bildebehandlingsteknologi, inkludert magnetisk resonansavbildning (MRI), computertomografi (CT) og røntgen, er også mye brukt i glomerulær deteksjon 12,13,14,15, men slike teknologier krever store instrumenter. Nye metoder, for eksempel matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) bildemassespektrometer16 eller tykk og tynnsnittmetode17, har også blitt brukt i glomerulær deteksjon, selv om de fortsatt er kjedelige og arbeidskrevende.

Ved hjelp av gjennomsiktighetsteknologier er det mulig å observere dypere dybder og få rikere og mer fullstendig informasjon fra tykt vev eller til og med hele organer 18,19,20,21,22,23. Derfor har åpenhetsteknologier blitt mye brukt i nyreforskning24. Observasjon og påvisning av glomeruli i de ryddede nyrene er også involvert. Imidlertid refererte disse publiserte artiklene enten bare kort til glomerulær deteksjon25 eller brukte vanskelige å oppnå merkingsmetoder som transgene dyr26, selvproduserte fargestoffer13 eller høykonsentrasjons antistoffinkubasjon27 for å merke glomeruli. I tillegg, selv om studier hadde analysert glomeruli i klarerte nyrer, var analysene alltid begrenset13 eller støttet seg på analysealgoritmer etablert av forfatterne selv26.

Vi har tidligere vist en mer praktisk måte å merke glomeruli i mus nyrer28. Ved å bruke Imaris fant vi ut at glomeruli-antall, frekvens og volum raskt kunne oppnås. Dermed presenterer vi her et mer tilgjengelig, omfattende og forenklet sett med metoder for å merke og analysere glomeruli av musnyrer.

Protocol

Voksne C57BL/6 mus (6 ukers alder, 25-30 g) ble brukt i denne studien. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med lokale forskrifter for dyrevelferd og eksperimentell etikk. Studien ble godkjent av West China Hospital of Sichuan University Biomedical Research Ethics Committee. 1. Glomeruli merking og vev forberedelse Glomeruli merkingLøs opp FITC-dextran (10 mg) i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i forholdet 1:1 (1 mg: 1 ml) for å klargjøre arbeidssondeopplø…

Representative Results

Denne studien gir en enkel og effektiv metode for merking og analyse av glomeruli i mus nyrer. Glomeruli (blodkar) kan være godt merket ved intravaskulært injisert FITC-Dextran. Etter clearingprosessen ble nyren gjennomsiktig (figur 1A), og glomeruli kunne tydelig observeres ved hjelp av lysarkmikroskopi (figur 1B) eller konfokalmikroskopi (figur 1C). Konfokalmikroskopi har begrenset skannedybde, så ny…

Discussion

Tissue-clearing teknologier kan klassifiseres i 3 eller 4 grupper 29,30,31. Organisk løsemiddelbasert vevsfjerning (f.eks. DISCO og PEGASOS), vandig vevsrydding (f.eks. CUBIC) og hydrogelinnebygging av vevsfjerning (f.eks. CLARITY) har alle blitt brukt i nyrerydding 25,26,28,32. CUBIC, som vi har vis…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (82204951) og Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).

Materials

4% PFA Biosharp 7007171800 Fixation reaagen
502 Glue  Deli 7146 For fixing the kidney to the sample fixing adapter 
Antipyrine Aladdin A110660 Clearing reagent
Brain Matrix RWD Life Science 1mm 40-75 Tissue slicing
Confocal microscopy Nikon A1plus Image acquisition
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD150S Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy  Zeiss Light sheet 7  Image acquisition
Mice Ensiweier Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) 
N-Butyldiethanolamine Aladdin B299095 Clearing reagent
Nicotinamide Aladdin N105042 Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz Sigma-Aldrich P3761
Tail vein fixator JINUOTAI JNT-FS35 Fix the mouse for vail injection
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Clearing reagent

Referências

  1. Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
  2. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
  4. Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
  5. Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
  6. Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
  7. Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
  8. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  9. Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
  10. Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
  11. Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
  12. Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
  13. Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
  14. Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
  15. Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
  16. Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
  17. Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
  18. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  20. Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
  21. Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
  22. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  23. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  24. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  25. Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
  26. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  27. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  28. Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
  29. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  30. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
  31. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  32. Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
  33. Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
check_url/pt/65973?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Bai, L., Wu, Y., Dai, W., Shi, Q., Wu, L., Zhang, J., Zheng, L. An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli. J. Vis. Exp. (204), e65973, doi:10.3791/65973 (2024).

View Video