Pseudomonas aeruginosa से Siderophore उत्पादन के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण
Summary
इस प्रोटोकॉल कुल siderophores के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों प्रदान करता है, pyoverdine, और Pseudomonas aeruginosa से pyochelin.
Abstract
स्यूडोमोनास एरुगिनोसा (पी. एरुगिनोसा) मेजबान में संक्रमण स्थापित करने के लिए विषाणु कारकों की एक विविध श्रेणी के उत्पादन के लिए जाना जाता है। ऐसा ही एक तंत्र साइडरोफोर उत्पादन के माध्यम से लोहे की सफाई है। एरुगिनोसा दो अलग-अलग साइडरोफोरस पैदा करता है: पायोचेलिन, जिसमें कम लौह-चेलेटिंग आत्मीयता होती है, और पाइओवरडाइन, जिसमें उच्च लौह-चेलेटिंग आत्मीयता होती है। यह रिपोर्ट दर्शाती है कि पाइवरडाइन को सीधे बैक्टीरियल सुपरनेटेंट से मात्रा निर्धारित की जा सकती है, जबकि मात्रा का ठहराव से पहले पाइओकेलिन को सुपरनेटेंट से निकालने की आवश्यकता होती है।
गुणात्मक siderophore उत्पादन का विश्लेषण करने के लिए प्राथमिक विधि क्रोम Azurol सल्फोनेट (सीएएस) अगर अगर प्लेट परख है. इस परख में, Fe3+-डाई कॉम्प्लेक्स से CAS डाई की रिहाई नीले से नारंगी रंग में परिवर्तन की ओर ले जाती है, जो साइडरोफोर उत्पादन का संकेत देती है। कुल साइडरोफोरस की मात्रा का ठहराव के लिए, बैक्टीरियल सुपरनेटेंट को माइक्रोटिटर प्लेट में सीएएस डाई के साथ समान अनुपात में मिलाया गया था, इसके बाद 630 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण किया गया था। Pyoverdine सीधे 50 मिमी Tris-HCl के साथ बराबर अनुपात में मिश्रण द्वारा बैक्टीरियल सतह पर तैरनेवाला से मात्रा निर्धारित की गई थी, इसके बाद स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण किया गया था। 380 एनएम पर एक चोटी ने पाइवरडाइन की उपस्थिति की पुष्टि की। पायोचेलिन के लिए, बैक्टीरियल सुपरनेटेंट से प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव संभव नहीं था, इसलिए इसे पहले निकाला जाना था। बाद के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण ने 313 एनएम पर एक चोटी के साथ पायोचेलिन की उपस्थिति का खुलासा किया।
Introduction
जीवों को विभिन्न महत्वपूर्ण कार्यों को करने के लिए लोहे की आवश्यकता होती है, जैसे इलेक्ट्रॉन परिवहन और डीएनए प्रतिकृति1. स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, एक ग्राम-नकारात्मक अवसरवादी रोगज़नक़, मेजबान में संक्रमण स्थापित करने के लिए विभिन्न प्रकार के विषाणु कारकों के अधिकारी के रूप में जाना जाता है, जिनमें से एक तंत्र साइडरोफोर गठन2 है। लोहे की कमी की स्थिति के दौरान, पी. एरुगिनोसा साइडरोफोरस नामक विशेष अणुओं को छोड़ता है, जो आसपास के वातावरण से लोहे को बुझाते हैं। साइडरोफोर्स लोहे को बाह्य रूप से काटते हैं, और परिणामस्वरूप फेरिक-साइडरोफोर कॉम्प्लेक्स को सक्रिय रूप से सेल3 में वापस ले जाया जाता है।
एरुगिनोसा को दो साइडरोफोरस, पायओवरडाइन और पायोचेलिन का उत्पादन करने के लिए जाना जाता है। पायवर्डाइन को उच्च आयरन चेलेटिंग आत्मीयता (1:1) के लिए जाना जाता है, जबकि पायोचेलिन को कम आयरन चेलेटिंग आत्मीयता (2:1)4 के लिए जाना जाता है। पायोकेलिन को द्वितीयक साइडरोफोर भी कहा जाता है क्योंकि इसमें कम आयरन केलेटिंग आत्मीयताहोती है 5. साइडरोफोरस का उत्पादन और विनियमन सक्रिय रूप से कोरम सेंसिंग (क्यूएस) सिस्टम द्वारा नियंत्रित किया जाता है पी. एरुगिनोसा6.
लोहे की शमन के अलावा, साइडरोफोरस भी विषाणु कारकों को विनियमित करने में शामिल हैं और बायोफिल्म गठन7 में सक्रिय भूमिका निभाते हैं। Siderophores अतिरिक्त महत्वपूर्ण भूमिकाओं, सेल संकेत में भागीदारी सहित, ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ रक्षा, और माइक्रोबियल समुदायों8 के बीच बातचीत की सुविधा की सेवा. साइडरोफोरस को आमतौर पर विशिष्ट कार्यात्मक समूहों के आधार पर वर्गीकृत किया जाता है जिसके माध्यम से वे लोहे को काटते हैं। इस वर्गीकरण में तीन प्राथमिक बिडेंटेट लिगैंड कैटेकोलेट, हाइड्रोक्सामेट और α-हाइड्रॉक्सीकार्बोक्सिलेट3 हैं। Pyoverdines फ्लोरोसेंट Pseudomonas प्रजातियों की पहचान कर रहे हैं जैसे P. aeruginosa और P. fluorescens5. इनमें एक मिश्रित हरे फ्लोरोसेंट क्रोमोफोर होते हैं जो एक ऑलिगोपेप्टाइड के साथ मिलकर होते हैं जिसमें 6-12 अमीनो एसिड होते हैं। कई गैर-राइबोसोमल पेप्टाइड सिंथेटेस (एनआरपी) उनके संश्लेषण9 में शामिल हैं। पाइवरडाइन उत्पादन और विनियमन में शामिल चार जीन पीवीडीएल, पीवीडीआई, पीवीडीजे और पीवीडीडी10 हैं। पायवरडाइन स्तनधारियों में संक्रमण और विषाणु के लिए भी जिम्मेदार है11. पी. aeruginosa मध्यम लौह सीमित शर्तों में pyochelin का उत्पादन करने के लिए उल्लेख किया है, जबकि pyoverdine गंभीर लौह सीमित वातावरण12 के दौरान उत्पादन किया जाता है. पायोचेलिन उत्पादन में शामिल दो ऑपेरॉन pchDCBA और pchEFGHI13 हैं। यह ध्यान दिया जाता है कि pyocyanin की उपस्थिति में, pyochelin (catecholate) ऑक्सीडेटिव क्षति और सूजन लाती है और हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी, जो मेजबान ऊतकों11 के लिए हानिकारक हैं उत्पन्न करता है.
क्रोम Azurol सल्फोनेट (सीएएस) परख व्यापक रूप से अपनी व्यापकता, उच्च संवेदनशीलता, और सूक्ष्मजीवविज्ञानी assays की तुलना में अधिक सुविधा के कारण अपनाया जाता है, जो, हालांकि संवेदनशील, अत्यधिक विशिष्ट14 हो सकता है. सीएएस परख अगर सतहों पर या एक समाधान में आयोजित किया जा सकता है. यह रंग परिवर्तन पर निर्भर करता है जो तब होता है जब फेरिक आयन अपने तीव्र नीले परिसर से नारंगी में परिवर्तित हो जाता है। सीएएस वर्णमिति परख एक Fe-CAS-सर्फैक्टेंट टर्नरी कॉम्प्लेक्स से लोहे की कमी को निर्धारित करता है। धातु, कार्बनिक डाई और सर्फेक्टेंट से मिलकर बने इस विशेष परिसर में एक नीला रंग होता है और 630 एनएम पर एक अवशोषण शिखर प्रदर्शित करता है।
यह रिपोर्ट साइडरोफोर उत्पादन के गुणात्मक पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करती है, जहां कोई अगर प्लेट पर साइडरोफोरस के उत्पादन का पता लगा सकता है। एक माइक्रोटिटर प्लेट में कुल साइडरोफोर उत्पादन के मात्रात्मक अनुमान के लिए एक विधि और दो साइडरोफोरस, पायवरडाइन और पायोचेलिन का पता लगाने और मात्रात्मक विश्लेषण, पी. एरुगिनोसा से भी प्रदान किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं कुल siderophores और पी के दो अलग siderophores मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाता है. aeruginosa, अर्थात् pyoverdine और pyochelin, जीवाणु कोशिका मुक्त सतह पर तैरनेवाला से. सीएएस अगर प्लेटों परख में, सीएएस डाई ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक DBT – जैव प्रौद्योगिकी शिक्षण कार्यक्रम, DBT – BUILDER कार्यक्रम और FIST से धन स्वीकार करते हैं। एसएचओडीएच से प्राप्त श्री धन्यवाद फेलोशिप। हिमाचल प्रदेश सीएसआईआर से प्राप्त फेलोशिप को धन्यवाद देता है।
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
Referências
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biologia. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong, , et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
