Nylige tekniske fremskridt muliggjorde den skalerede produktion af en in vitro-platform til lægemiddelmetabolisme og toksicitetsapplikationer. Et helt menneskeligt 2D+ leversystem (TV2D+) giver fysiologisk relevante resultater ved hjælp af traditionelle todimensionelle dyrkningsmetoder. Denne protokol understøtter slutbrugere i opsætning, vedligeholdelse og anvendelse af systemet.
Det er fortsat en udfordring at finde en langsigtet, humanrelevant kulturmodel for primære humane hepatocytter (PHH’er) til farmakologiske og toksikologiske undersøgelser. Nuværende in vitro-modelplatforme er ofte ubelejlige og komplekse, mangler fænotypisk stabilitet over tid og understøtter ikke flere PH-partier, der mangler eksperimentel reproducerbarhed og fleksibilitet. Her leverer vi en detaljeret protokol til optøning, plettering og vedligeholdelse af et menneskeligt 2D + leversystem (TV2D +), der udnytter standard todimensionelle (2D) kulturteknikker og udstyr, samtidig med at levetiden og fænotypisk stabilitet over tid, der typisk ledsager mere komplekse tredimensionelle (3D) systemer, opretholdes. Resultaterne viser vedhæftning og procent blodpladeevne i TV2D+ som funktion af PHH såtæthed samt stabil funktionalitet i mindst 2 uger i kultur. En række PHH-såtætheder vurderes for at opnå en vellykket langsigtet kultur. Når de er etableret korrekt, organiserer PHH’erne i TV2D + sig i hepatocytkolonier, udtrykker en hepatisk-specifik markør og opretholder levedygtighed, arkitektonisk integritet og fysiologisk relevante niveauer af albumin og urinstof. Denne unikke kombination af egenskaber gør TV2D+-systemet til en velegnet levermodel til en række farmakologiske og toksikologiske anvendelser.
Forudsigelse af terapeutisk sikkerhed og effekt er en vigtig del af udviklingen af prækliniske lægemidler. Imidlertid er konventionelle prækliniske in vitro levermodeller begrænsede i deres evne til nøjagtigt at efterligne in vivo levercellulære mikromiljø og opretholde hepatocytfunktionalitet og morfologi over tid. Der er behov for modeller, der giver stabil metabolisk kompetence i mere end 1 uge til at vurdere forbindelser med langsom omsætning eller undersøge resultater forbundet med subakut eller kronisk eksponering. In vivo dyreforsøg kan ofte ikke forudsige lægemidlets effektivitet og risiko på grund af translationelle artsforskelle i humane hepatiske clearancemekanismer1. Nuværende in vitro 2-dimensionelle (2D) levermodeller, såsom traditionel primær human hepatocyt (PHH) monokultur eller sandwichkulturer, mangler fænotypisk stabilitet og levetid i kultur, hvilket fører til tab af nøgle hepatocellulær funktion og arkitektonisk integritet over tid2. En alternativ metode involverer dannelsen af 3-dimensionelle (3D) hepatocytsfæroider, der tilbyder et mere relevant mikromiljø versus 2D-kultur. Denne metode er imidlertid begrænset af tilgængeligheden af råmaterialer, udvælgelse af PHH-donorpartier, reproducerbarhed og tab af levedygtighed med stigende sfærisk størrelse 3,4,5,6. Multicellulære platforme er blevet introduceret, hvorved PHH’er podes med fødeceller på mikromønstrede plader i fast størrelse. Selvom disse modeller kan muliggøre længere dyrkningstider, kan ikke-humane fødeceller, der anvendes i disse platforme, ændre eksperimentelle resultater og begrænse deres anvendelse på grund af medfødt baggrundsbidrag til lægemiddelclearance og metaboliske profiler 1,7. TruVivo all-human 2D + hepatisk system (TV2D +), der for nylig blev beskrevet i Weaver, et al8, blev udviklet til at løse nogle af begrænsningerne ved traditionelle, co-kultur og 3D-kulturmetoder af PHH’er. De ikke-leverføderceller reducerer forskellene mellem arterne i metabolisme og parakrin produktion og giver den nødvendige støtte til primære hepatocytter på en reproducerbar, robust måde, der ikke kan leveres af tilsvarende ikke-parenkymale leverceller fra et enkelt donorparti på grund af begrænsninger i ekspansion, fænotype og ydeevne. De valgte fødeceller kunne udvides konsekvent før brug og manglede behovet for transformation eller differentiering. Som beskrevet af Glicklis et al.4 og Khetani et al.5 har 3D-kulturmodeller som hepatocytsfæroider udfordringer med reproducerbarhed på grund af donorvariabilitet og opretholdelse af konsistens i sfærisk størrelse, hvilket påvirker næringsstofdiffusion i sfæroider større end 200 μm, hvilket fører til nedsat levedygtighed og funktionalitet. Ligesom 3D-sfærisk dannelse er TV2D + -systemet afhængig af selvmontering af PHH’er; imidlertid spredes de dannede PHH-kolonier over brøndens overfladeareal i en enkeltcelledybde snarere end komprimeret til et enkelt aggregat. Denne dyrkningsmetode kan være nyttig til at adressere donorvariabilitet, så PHH’er kan belægges, dyrkes og opretholde grundlæggende funktionalitet ved forskellige såtætheder. TV2D + -systemet kan også øge robustheden af brugerhåndtering på grund af tab under manipulation eller specialudstyr, der kræves for at udføre udvidet kultur i 3D-sfæroider.
TV2D+-systemet kombinerer standard 2D-kultur med den levetid og fænotypiske stabilitet, der typisk ledsager 3D-systemer. Protokollen beskrevet heri giver trinvise anvisninger til brugere med grundlæggende vævskulturfærdigheder i laboratorier udstyret med standardudstyr såsom biosikkerhedsskabe, centrifuger og CO2 -inkubatorer. Hvert trin i processen er beskrevet detaljeret, herunder medieforberedelse, optøning, plettering og vedligeholdelse af det resulterende kultursystem. Protokollen indeholder også en metode til bestemmelse af basiske hepatocytfunktionalitetsudgange, albumin og urinstof samt immunofluorescerende billedanalyse til bestemmelse af PH-vedhæftning til normalisering. Når de er etableret korrekt, organiserer PHH’erne i TV2D + sig i hepatocytkolonier, efterligner den oprindelige levermorfologi og opretholder udvidet levedygtighed, arkitektonisk integritet og fysiologisk relevante niveauer af albumin og urinstof i mindst 2 uger8. Fordi systemet kan tillade en række PHH-såtætheder, kan det være nyttigt at øge tilgængeligheden af mindre pladebare PHH-partier, der har ønskelige donoregenskaber. Denne kombination af tilgængelighed og funktionalitet gør TV2D+ til en velegnet levermodel til en række farmakologiske og toksikologiske anvendelser.
Det beskrevne leverkultursystem kan etableres i laboratorier, der er udstyret med standard vævskulturinstrumentering. Systemet består af PHH’er dyrket med føderceller og giver brugeren mulighed for at dyrke PHH’er i mindst to uger med stabil albuminproduktion og urinstofsyntese. På grund af PHH-donorpartiets variabilitet anbefales kun forhåndsscreenede og kvalificerede PHH’er til brug i systemet. Selv om antallet af vedhæftede PHH’er varierer afhængigt af donorparti og såtæthed, forbliver den relative blodpladedannelse den samme inden for hvert donorparti. Mens anbefalede såtætheder anbefales, antyder ovenstående data, at hepatocytsåtætheden kan justeres til forskellige eksperimentelle behov; Det skal dog bemærkes, at såning af et større antal PHH’er muligvis ikke giver højere eller mere konsistente funktionelle output. Analyse af de evaluerede PHH-partier viste det laveste CV for albuminproduktion og urinstofsyntese ved hjælp af lavere såtætheder på 150.000 PHH’er / brønd og 200.000 PHH’er / brønd; Der blev imidlertid ikke fundet signifikante forskelle mellem albumin og urinstof ved nogen såtæthed. Højere såtætheder på 250.000 PHH’er / brønd og 300.000 PHH’er / brønd viser et større fald i albumin og urinstof i løbet af den 14-dages dyrkningsperiode. Iboende donorvariabilitet i blodpladedannelse kan påvirke konsistensen af albuminproduktion og urinstofsyntese ved 250.000 PHH’er/brønd og 300.000 PHH/brønd for de testede donorpartier. I lighed med store hepatocytsfæroider kan oversåning af PHH’er i TV2D + -systemet have negative virkninger på den langsigtede kultur og funktionalitet af PHH’er.
Alle trin i optøning, plettering og vedligeholdelse er afgørende for vellykket kultur og datagenerering; Der er dog flere almindelige fejl, som uerfarne brugere kan undgå. PHH’er er meget modtagelige for skader sekundært til temperaturudsving, forskydningsspænding og udsættelse for luft 9,10. Der bør træffes forholdsregler ved optøning af PHH’er for at undgå forlængede optøningstidsrammer og overdreven pipettering. Brug af en håndhældningsmetode, en timer og øjeblikkelig overførsel fra vandbad til is vil reducere disse almindelige fejl, der kan påvirke levedygtigheden og blodpladeevnen af PHH’erne. Derudover, med forsyningskædeproblemer, der bliver mere almindelige, kan det være vanskeligt at få kollagenbelagte plader. Manuel belægning af vævskulturbehandlede plader ved hjælp af kommercielle opløsninger af kollagen type I (5-10 μg/cm2) kan anvendes til at løse dette problem; For optimal ydeevne og konsistens anbefales det dog at bruge forbelagte kollagenplader. I overgangsprocessen fra feedercellekultur til introduktion af PHH’er er det afgørende at forhindre, at fødecellelaget tørrer. Tillad aldrig lufteksponering for fødercellerne. Enhver lufteksponeringstid kan føre til dårlig fødecellelagskvalitet, hvilket vil påvirke den langsigtede kultur af PHH’er negativt. Det er bedste praksis at lade en lille mængde restmedium forblive mellem medieændringer. Lejlighedsvis kan PHH’er indeholde overskydende affald fra isolering, hvilket kan gøre det vanskeligt at se morfologi. For at hjælpe med dette problem skal du ryste pladen før et medium skift og bruge vakuumaspiration. Endelig, når du udfører en mediumændring, skal du forsigtigt aspirere det brugte medium og passe på ikke at forstyrre de dyrkede celler. Pipetter frisk medium volumen ned ad siden af brønden for at undgå pipettering direkte på cellelaget. Brugeren bør også undgå lufteksponering ved hvert medieskift ved hjælp af det anbefalede 3-brøndsskift (punkt 3 og 4). Det skal også bemærkes, at en daglig medieændring er ideel, men ikke påkrævet.
Selvom fluorescerende mikroskoper er blevet almindelige i de fleste laboratorier, kan software, der er nødvendig for at udføre specifik billedanalyse, medføre yderligere udgifter. ImageJ kan downloades gratis, hvilket gør det til et let tilgængeligt billedanalyseværktøj. Trinene i protokollen giver et grundlag, som brugeren muligvis skal optimere, specifikt partikelanalyse af DAPI-farvning; Hvis der imidlertid ikke er mulighed for fluorescerende billeddannelse, angives PHH-vedhæftningsværdier på dag 14 på partispecifikke analysecertifikater. Dårlig tærskelværdi vil resultere i unøjagtig optælling af DAPI-partiklerne. Det anbefales også at kontrollere overfladearealet af individuelle DAPI-partikler, inden der indstilles en størrelsesudelukkelse. Dette kan opnås ved at bruge det ovale ikon [Figur 2 (1), cirkelikon under fanen Rediger ] og tegne en cirkel, der omfatter DAPI-partiklen. Fanen Analysér kan derefter bruges til at måle arealet af den valgte DAPI-partikel. Specifikke målinger kan vælges ved hjælp af Indstil målinger under fanen Analysér [trin 8.9 og figur 2 (4)].
Nuværende metoder til dyrkning af PHH’er involverer anvendelse af belægninger såsom kollagen-I til at øge cellebinding i traditionel 2-dimensionel monokultur11 eller overlejring med en ekstracellulær matrix, som den murinbaserede Matrigel, en teknik, der almindeligvis omtales som “sandwichkultur”12,13,14,15. Mens sandwichkulturteknikken forbedrer PHH-morfologi og polaritet over tid sammenlignet med traditionel monokultur, mangler begge tilgange stadig langsigtet fænotypisk stabilitet i kultur for de fleste pladebare masser af PHH’er. En anden metode, der bruges til at dyrke PHH’er, er at lave 3D-sfæroider; Som tidligere nævnt af Glicklis et al.4 kan der dog være tekniske udfordringer med reproducerbarhed af sfærisk størrelse på grund af donorvariabilitet. I et forsøg på at lave en mere fysiologisk relevant levermodel er der udviklet flercellede modeller. Som beskrevet af Ware et al.7 muliggjorde anvendelse af mikromønstre, murinfibroblaster og primære humane lever-sinusformede endotelceller omgivet af PHH’er længere in vitro-dyrkningstider. Imidlertid kan mikromønster være en kompleks og tidskrævende proces, og de ikke-menneskelige fødeceller kan bidrage til baggrund i metaboliske signaler, hvilket begrænser nytten af denne platform i visse applikationer. Anvendelsen af forskellige ikke-leverceller, herunder humane og rottedermale fibroblaster og bovin aortaendotelceller som fødeceller til samdyrkning af hepatocytter, har vist albuminsekretion og tæt forbindelsesdannelse svarende til cokulturer af fødeceller af leveroprindelse16. Imidlertid skal mekanismen for interaktioner mellem TV2D + ikke-leverføderceller og PHH’erne i kultur undersøges yderligere for bedre at forstå indflydelsen på stabiliteten og funktionaliteten af PHH’erne i dette system. Kultursystemet, der tidligere er beskrevet af Weaver et al.8, kan med succes dyrke PHH’er i leverkolonier i op til 42 dage og danne omfattende galdekanalnetværk. De PHH’er, der blev dyrket i dette system, opretholdt vigtig leverfunktionalitet, herunder cytokrom 1A2-, 2B6- og 3A4-aktivitet og uridin-5′-diphospho-glucuronosyltransferase (UGT)-baseret enzymaktivitet, fase I- og II-metabolitdannelse, albuminproduktion og urinstofsyntese i mindst 22 dage in vitro uden Matrigel. Dette dyrkningssystem producerer stabile, fysiologisk relevante output, der let kan tilpasses ethvert laboratorium til farmakologiske og toksikologiske anvendelser. Selvom vigtige PH-funktioner bevares i TV2D + -systemet, er der ikke foretaget nogen direkte sammenligninger med 3D-sfæroidmodellen; Fremtidigt arbejde med at sammenligne de samme PHH-donorer mellem dyrkningssystemerne vil imidlertid vise sig værdifuldt til at bestemme grænserne og fordelene ved begge metoder.
Potentielle anvendelser af TV2D + omfatter evaluering af metabolisk clearance og lægemiddelinteraktioner mellem stoffer med lav omsætning, lægemiddelinduceret leverskade og risikovurdering af agrokemikalier. Præcis forudsigelse af leverclearance af nye og fremspirende lægemidler afhænger af en stabil og langvarig PH-kultur med tilbageholdelse af vigtig hepatocellulær funktionalitet, hvilket er særligt udfordrende ved evaluering af forbindelser med lav omsætning. Derudover er risikovurdering og kemisk induceret levertoksicitet store sundhedsmæssige bekymringer, og de nuværende modeller giver ikke den langsigtede stabilitet og funktionalitet i kultur til nøjagtigt at evaluere potentiel kronisk kemisk toksicitet, der kan være sekundær til akut eksponering. Sunde og syge PHH’er dyrket i TV2D + viste karakteristiske forskelle i funktion og lipiddisposition, der blev bevaret over tid17. Disse undersøgelser understøtter TV2D+ som et lovende værktøj til en række farmakologiske og toksikologiske anvendelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Mellissa Keller og Wendy Hetman for deres hjælp med manuskript og figurgennemgang.
0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |