Nylige tekniske fremskritt muliggjorde skalert produksjon av en in vitro-plattform for legemiddelmetabolisme og toksisitetsapplikasjoner. Et helmenneskelig 2D+ leversystem (TV2D+) gir fysiologisk relevante resultater ved hjelp av tradisjonelle todimensjonale dyrkningsmetoder. Denne protokollen vil støtte sluttbrukere i oppsett, vedlikehold og bruk av systemet.
Det er fortsatt en utfordring å finne en langsiktig, humanrelevant kulturmodell for primære humane hepatocytter (PHH) for farmakologiske og toksikologiske studier. Nåværende in vitro-modellplattformer er ofte upraktiske og komplekse, mangler fenotypisk stabilitet over tid, og støtter ikke flere PHH-partier, mangler eksperimentell reproduserbarhet og fleksibilitet. Her gir vi en detaljert protokoll for tining, plating og vedlikehold av et helt menneskelig 2D + leversystem (TV2D +), som utnytter standard todimensjonale (2D) kulturteknikker og utstyr samtidig som levetiden og fenotypisk stabilitet over tid opprettholdes som vanligvis følger med mer komplekse tredimensjonale (3D) systemer. Resultatene viser feste og prosent platebarhet i TV2D+ som funksjon av PHH såtetthet, samt stabil funksjonalitet i minst 2 uker i kultur. En rekke PHH-såtettheter vurderes for å oppnå en vellykket langsiktig kultur. Når de er etablert riktig, organiserer PHH-ene i TV2D+ seg i hepatocyttkolonier, uttrykker en leverspesifikk markør og opprettholder levedyktighet, arkitektonisk integritet og fysiologisk relevante nivåer av albumin og urea. Denne unike kombinasjonen av egenskaper gjør TV2D+-systemet til en egnet levermodell for en rekke farmakologiske og toksikologiske applikasjoner.
Forutsi terapeutisk sikkerhet og effekt er en viktig del av preklinisk legemiddelutvikling. Imidlertid er konvensjonelle prekliniske in vitro levermodeller begrenset i deres evne til nøyaktig å etterligne in vivo levercellulært mikromiljø og opprettholde hepatocyttfunksjonalitet og morfologi over tid. Det er behov for modeller som gir stabil metabolsk kompetanse i mer enn 1 uke for å vurdere langsomme omsetningsforbindelser eller undersøke utfall assosiert med subakutt eller kronisk eksponering. In vivo dyreforsøk klarer ofte ikke å forutsi legemiddeleffekt og risiko på grunn av translasjonsforskjeller i humane leverclearancemekanismer1. Nåværende in vitro 2-dimensjonale (2D) levermodeller, som tradisjonell primær human hepatocytt (PHH) monokultur eller sandwichkulturer, mangler fenotypisk stabilitet og lang levetid i kultur, noe som fører til tap av viktig hepatocellulær funksjon og arkitektonisk integritet over tid2. En alternativ metode innebærer dannelse av 3-dimensjonale (3D) hepatocyttsfæroider, som tilbyr et mer relevant mikromiljø versus 2D-kultur. Imidlertid er denne metoden begrenset av tilgjengeligheten av råvarer, PHH donor-lot utvalg, reproduserbarhet og tap av levedyktighet med økende sfæroid størrelse 3,4,5,6. Flercellede plattformer har blitt introdusert der PHH blir sådd med materceller på mikromønstrede plater i fast størrelse. Selv om disse modellene kan muliggjøre lengre kulturtider, kan ikke-menneskelige materceller som brukes i disse plattformene endre eksperimentelle resultater og begrense deres anvendelse på grunn av medfødt bakgrunnsbidrag til legemiddelclearance og metabolske profiler 1,7. TruVivo all-human 2D + leversystemet (TV2D +) nylig beskrevet i Weaver, et al8, ble utviklet for å løse noen av begrensningene i tradisjonelle, samkultur og 3D-kulturmetoder for PHH. De ikke-levermaterceller reduserer forskjellene mellom arter i metabolisme og parakrin produksjon og gir den støtten som er nødvendig for primære hepatocytter på en reproduserbar, robust måte som ikke kan leveres av tilsvarende ikke-parenkymale leverceller fra et enkelt donorparti på grunn av begrensninger i ekspansjon, fenotype og ytelse. De valgte matercellene kunne utvides konsekvent før bruk og manglet behovet for transformasjon eller differensiering. Som beskrevet av Glicklis et al.4 og Khetani et al.5, har 3D-kulturmodeller som hepatocytt-sfæroider utfordringer med reproduserbarhet på grunn av donorvariabilitet og opprettholdelse av konsistens i sfæroidstørrelse, noe som påvirker næringsdiffusjon i sfæroider større enn 200 μm, noe som fører til redusert levedyktighet og funksjonalitet. I likhet med 3D-sfæroiddannelse er TV2D+-systemet avhengig av selvmontering av PHH-er; Imidlertid er de dannede PHH-koloniene spredt over overflaten av brønnen på en enkeltcelledybde i stedet for komprimert til et enkelt aggregat. Denne kulturmetoden kan være nyttig for å adressere donorvariabilitet, slik at PHHer kan belagt, dyrkes og opprettholde grunnleggende funksjonalitet ved forskjellige såtettheter. TV2D+-systemet kan også øke robustheten til brukerhåndtering på grunn av tap under manipulering eller spesialutstyr som kreves for å utføre utvidet kultur i 3D-sfæroider.
TV2D+-systemet kombinerer standard 2D-kultur med lang levetid og fenotypisk stabilitet som vanligvis følger med 3D-systemer. Protokollen beskrevet her gir trinnvise instruksjoner for brukere med grunnleggende vevskulturferdigheter i laboratorier utstyrt med standardutstyr som biosikkerhetsskap, sentrifuger og CO2 -inkubatorer. Hvert trinn i prosessen er skissert i detalj, inkludert medieforberedelse, tining, plating og vedlikehold av det resulterende kultursystemet. Protokollen inneholder også en metode for å bestemme grunnleggende hepatocyttfunksjonalitetsutganger, albumin og urea, samt immunfluorescerende bildeanalyse for å bestemme PHH-vedlegg for normalisering. Når de er etablert riktig, organiserer PHHene i TV2D + seg i hepatocyttkolonier, etterligner den opprinnelige levermorfologien, og opprettholder utvidet levedyktighet, arkitektonisk integritet og fysiologisk relevante nivåer av albumin og urea i minst 2 uker8. Fordi systemet kan tillate en rekke PHH-såtettheter, kan det være nyttig for å øke tilgjengeligheten av mindre platable PHH-partier som har ønskelige donoregenskaper. Denne kombinasjonen av tilgjengelighet og funksjonalitet gjør TV2D+ til en egnet levermodell for en rekke farmakologiske og toksikologiske applikasjoner.
Det beskrevne leverkultursystemet kan etableres i laboratorier som er utstyrt med standard vevskulturinstrumentering. Systemet består av PHH-er dyrket med materceller, og lar brukeren dyrke PHH i minst to uker med stabil albuminproduksjon og ureasyntese. På grunn av variasjon i PHH-donorpartier anbefales kun forhåndsscreenede og kvalifiserte PHH-er for bruk i systemet. Selv om antall festede PHH-er varierer basert på donorparti og såtetthet, forblir den relative platebarheten lik innenfor hvert donorparti. Selv om anbefalte såtettheter anbefales, antyder dataene ovenfor at hepatocyttsåingstetthet kan justeres for forskjellige eksperimentelle behov; Det skal imidlertid bemerkes at seeding av et større antall PHHer kanskje ikke gir høyere eller mer konsistente funksjonelle utganger. Analyse av de evaluerte PHH-partiene viste lavest CV for albuminproduksjon og ureasyntese ved bruk av lavere såtetthet på 150 000 PHH/brønn og 200 000 PHHs/brønn; Det ble imidlertid ikke funnet signifikante forskjeller mellom albumin og urea ved noen såingstetthet. Høyere såtetthet på 250 000 PHH/brønn og 300 000 PHHs/brønn viser en større nedgang i albumin og urea i løpet av 14-dagers kulturperioden. Iboende donorvariabilitet i platebarhet kan påvirke konsistensen av albuminproduksjon og ureasyntese ved 250 000 PHHs/brønn og 300 000 PHHs/well for de testede donorpartiene. I likhet med store hepatocyttsfæroider, kan overseeding av PHH i TV2D + -systemet ha negative effekter på den langsiktige kulturen og funksjonaliteten til PHH.
Alle trinn i tining, plating og vedlikehold er avgjørende for vellykket kultur og datagenerering; Det er imidlertid flere vanlige feil uerfarne brukere kan unngå. PHH er svært utsatt for skader sekundært til temperatursvingninger, skjærspenning og eksponering for luft 9,10. Forholdsregler bør tas ved tining av PHH for å unngå langvarig tinetid og overdreven pipettering. Bruken av en håndhellemetode, en tidtaker og umiddelbar overføring fra vannbad til is vil redusere disse vanlige feilene som kan påvirke levedyktigheten og platabiliteten til PHH-ene. I tillegg, med forsyningskjedeproblemer som blir vanligere, kan det være vanskelig å skaffe kollagenbelagte plater. Manuelt belegg av vevskulturbehandlede plater ved bruk av kommersielle løsninger av kollagen type I (5-10 μg / cm2) kan brukes til å overvinne dette problemet; For optimal ytelse og konsistens anbefales det imidlertid å bruke forhåndsbelagte kollagenplater. I prosessen med overgang fra matercellekultur til innføring av PHH, er det kritisk å forhindre at matercellelaget tørker ut. Tillat aldri lufteksponering til matercellene. Enhver lufteksponeringstid kan føre til dårlig matercellelagskvalitet, noe som vil påvirke den langsiktige kulturen til PHH negativt. Det er beste praksis å la en liten mengde gjenværende medium forbli mellom middels endringer. Noen ganger kan PHH inneholde overflødig rusk fra isolasjon, noe som kan gjøre det vanskelig å se morfologi. For å hjelpe med dette problemet, rist platen før en middels endring og bruk vakuumaspirasjon. Til slutt, når du utfører en middels forandring, må du forsiktig aspirere det brukte mediet, og pass på at du ikke forstyrrer de dyrkede cellene. Pipett friskt mediumvolum ned på siden av brønnen for å unngå pipettering direkte på cellelaget. Brukeren bør også unngå lufteksponering ved hver middels endring, ved å bruke den anbefalte 3-brønnsendringen (avsnitt 3 og 4). Det skal også bemerkes at en daglig middels endring er ideell, men ikke nødvendig.
Selv om fluorescerende mikroskoper har blitt vanlig i de fleste laboratorier, kan programvare som trengs for å utføre spesifikk bildeanalyse medføre ekstra utgifter. ImageJ kan lastes ned gratis, noe som gjør det til et lett tilgjengelig bildeanalyseverktøy. Trinnene i protokollen gir et grunnlag som brukeren kan trenge å optimalisere, spesielt partikkelanalyse av DAPI-farging; I fravær av fluorescerende avbildningsevne er imidlertid PHH-festeverdier ved dag 14 angitt på partispesifikke analysesertifikater. Dårlig terskel vil føre til unøyaktig telling av DAPI-partiklene. Det anbefales også å sjekke overflaten av individuelle DAPI-partikler før du angir en størrelsesekskludering. Dette kan oppnås ved å bruke det ovale ikonet [Figur 2 (1), sirkelikonet under fanen Rediger ] og tegne en sirkel som omfatter DAPI-partikkelen. Kategorien Analyser kan deretter brukes til å måle arealet til den valgte DAPI-partikkelen. Spesifikke målinger kan velges ved hjelp av Angi målinger under fanen Analyser [trinn 8.9 og figur 2 (4)].
Nåværende metoder for dyrking av PHH involverer bruk av belegg som kollagen-I for å øke cellefeste i tradisjonell 2-dimensjonal monokultur11 eller overlegg med en ekstracellulær matrise, som murinbasert Matrigel, en teknikk som ofte refereres til som “sandwichkultur”12,13,14,15. Mens sandwichkulturteknikken forbedrer PHH-morfologi og polaritet over tid sammenlignet med tradisjonell monokultur, mangler begge tilnærmingene fortsatt langsiktig fenotypisk stabilitet i kultur for de fleste tallerkenable partier av PHH. En annen metode som brukes til å dyrke PHHer er å lage 3D-sfæroider; Som tidligere nevnt av Glicklis et al.4, kan det imidlertid være tekniske utfordringer med reproduserbarhet av sfæroidstørrelse på grunn av donorvariabilitet. I et forsøk på å lage en mer fysiologisk relevant levermodell, har flercellede modeller blitt utviklet. Som beskrevet av Ware et al.7, ved bruk av mikropatterning, aktiverte murine fibroblaster og primære humane lever sinusoid endotelceller omgitt av PHHs lengre in vitro kulturtider. Imidlertid kan mikropatterning være en kompleks og tidkrevende prosess, og de ikke-menneskelige matercellene kan bidra til bakgrunn i metabolske signaler, og begrense nytten av denne plattformen i visse applikasjoner. Bruken av forskjellige ikke-leverceller, inkludert humane og rotte dermale fibroblaster og bovine aorta endotelceller som materceller for samkultur av hepatocytter har vist albuminsekresjon og tett kryssdannelse som ligner på kokulturer av materceller av leveropprinnelse16. Imidlertid må mekanismen for interaksjoner mellom TV2D + ikke-levermaterceller og PHHene i kultur undersøkes videre for bedre å forstå innflytelsen på stabiliteten og funksjonaliteten til PHHene i dette systemet. Kultursystemet som tidligere ble beskrevet av Weaver et al.8 kan med hell dyrke PHH i leverkolonier i opptil 42 dager, og danne omfattende gallekanalikulære nettverk. PHHene dyrket i dette systemet opprettholdt viktig leverfunksjonalitet, inkludert cytokrom 1A2, 2B6 og 3A4 aktivitet og uridin 5′-difosfo-glukuronosyltransferase (UGT)-basert enzymaktivitet, fase I og II metabolittdannelse, albuminproduksjon og ureasyntese i minst 22 dager in vitro uten Matrigel. Dette kultursystemet produserer stabile, fysiologisk relevante utganger som lett kan tilpasses ethvert laboratorium for farmakologiske og toksikologiske applikasjoner. Selv om viktige PHH-funksjoner opprettholdes i TV2D+-systemet, er det ikke gjort direkte sammenligninger med 3D-sfæroidmodellen; Imidlertid vil fremtidig arbeid som sammenligner de samme PHH-giverne mellom kultursystemene vise seg å være verdifullt for å bestemme grensene og fordelene ved begge metodene.
Potensielle anvendelser av TV2D + inkluderer evaluering av metabolsk clearance og legemiddelinteraksjoner av forbindelser med lav omsetning, legemiddelindusert leverskade og risikovurdering av landbrukskjemikalier. Nøyaktig prediksjon av leverclearance av nye og framvoksende legemidler er avhengig av en stabil og langvarig PHH-kultur med retensjon av viktig hepatocellulær funksjonalitet, noe som er spesielt utfordrende ved evaluering av forbindelser med lav omsetning. I tillegg er risikovurdering og kjemisk indusert levertoksisitet store helseproblemer, og dagens modeller gir ikke langsiktig stabilitet og funksjonalitet i kultur for nøyaktig å evaluere potensiell kronisk kjemisk toksisitet som kan være sekundær til akutt eksponering. Friske og syke PHHer dyrket i TV2D+ viste karakteristiske forskjeller i funksjon og lipiddisposisjon som ble beholdt over tid17. Disse studiene støtter TV2D+ som et lovende verktøy for en rekke farmakologiske og toksikologiske anvendelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Mellissa Keller og Wendy Hetman for deres hjelp med manus- og figurgjennomgang.
0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |