De senaste tekniska framstegen har möjliggjort en storskalig produktion av en in vitro-plattform för läkemedelsmetabolism och toxicitetstillämpningar. Ett helt mänskligt 2D+ leversystem (TV2D+) ger fysiologiskt relevanta resultat med traditionella tvådimensionella odlingsmetoder. Detta protokoll kommer att stödja slutanvändare i installation, underhåll och tillämpning av systemet.
Att hitta en långsiktig, humanrelevant odlingsmodell för primära humana hepatocyter (PHH) för farmakologiska och toxikologiska studier är fortfarande en utmaning. Nuvarande in vitro-modellplattformar är ofta obekväma och komplexa, saknar fenotypisk stabilitet över tid och stöder inte flera PHH-partier, vilket saknar experimentell reproducerbarhet och flexibilitet. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för upptining, plätering och underhåll av ett helt mänskligt 2D+ leversystem (TV2D+), som drar nytta av standard tvådimensionella (2D) odlingstekniker och utrustning samtidigt som livslängden och fenotypisk stabilitet över tid bibehålls som vanligtvis följer med mer komplexa tredimensionella (3D) system. Resultaten visar vidhäftning och procentuell plattabilitet i TV2D+ som en funktion av PHH-såddtäthet, samt stabil funktionalitet under minst 2 veckor i odling. En rad PHH-såddtätheter bedöms för att uppnå en framgångsrik långsiktig odling. När PHH:erna i TV2D+ etableras på rätt sätt organiserar de sig i hepatocytkolonier, uttrycker en leverspecifik markör och bibehåller livskraft, arkitektonisk integritet och fysiologiskt relevanta nivåer av albumin och urea. Denna unika kombination av egenskaper gör TV2D+-systemet till en lämplig levermodell för en mängd olika farmakologiska och toxikologiska tillämpningar.
Att förutsäga terapeutisk säkerhet och effekt är en viktig del av preklinisk läkemedelsutveckling. Konventionella prekliniska in vitro-levermodeller är dock begränsade i sin förmåga att exakt efterlikna leverns cellulära mikromiljö in vivo och bibehålla hepatocytfunktionalitet och morfologi över tid. Det finns ett behov av modeller som ger stabil metabolisk kompetens i mer än 1 vecka för att bedöma föreningar med långsam omsättning eller undersöka resultat i samband med subakut eller kronisk exponering. In vivo-djurförsök misslyckas ofta med att förutsäga läkemedels effekt och risk på grund av translationella artskillnader i humana leverclearancemekanismer1. Nuvarande in vitro 2-dimensionella (2D) levermodeller, såsom traditionella primära humana hepatocyter (PHH) monokulturer eller sandwichkulturer, saknar fenotypisk stabilitet och livslängd i odlingen, vilket leder till förlust av viktiga hepatocellulära funktioner och arkitektonisk integritet över tid2. En alternativ metod involverar bildandet av 3-dimensionella (3D) hepatocytsfäroider, vilket ger en mer relevant mikromiljö jämfört med 2D-odling. Denna metod begränsas dock av tillgången på råvaror, PHH-donatorpartival, reproducerbarhet och förlust av livskraft med ökande sfäroidstorlek 3,4,5,6. Flercelliga plattformar har introducerats där PHH:er sås med matarceller på mikromönstrade plattor med fast storlek. Även om dessa modeller kan möjliggöra längre odlingstider, kan icke-humana feederceller som används i dessa plattformar förändra experimentella resultat och begränsa deras tillämpning på grund av medfött bakgrundsbidrag till läkemedelsclearance och metaboliska profiler 1,7. Det helmänskliga 2D+-hepatiska systemet (TV2D+) som nyligen beskrevs i Weaver, et al8, utvecklades för att ta itu med några av begränsningarna i traditionella, samkultur- och 3D-odlingsmetoder för PHH. De icke-leverätande cellerna minskar skillnaderna mellan arterna i metabolism och parakrin produktion och ger det stöd som krävs för primära hepatocyter på ett reproducerbart, robust sätt som inte kan tillhandahållas av motsvarande icke-parenkymala leverceller från ett enda donatorparti på grund av begränsningar i expansion, fenotyp och prestanda. De valda matarcellerna kunde konsekvent expanderas före användning och saknade behov av omvandling eller differentiering. Som beskrivits av Glicklis et al.4 och Khetani et al.5 har 3D-odlingsmodeller som hepatocytsfäroider utmaningar med reproducerbarhet på grund av donatorvariabilitet och upprätthållande av konsistens i sfäroidstorlek, vilket påverkar näringsdiffusion i sfäroider större än 200 μm, vilket leder till minskad livskraft och funktionalitet. Precis som 3D-sfäroidbildning förlitar sig TV2D+-systemet på självmontering av PHH; De PHH-kolonier som bildas sprids dock över brunnens yta på ett encellsdjup snarare än att komprimeras till ett enda aggregat. Denna odlingsmetod kan vara användbar för att hantera donatorvariabilitet, vilket gör att PHH:er kan plattas, odlas och bibehålla grundläggande funktionalitet vid olika såddtätheter. TV2D+-systemet kan också öka robustheten i användarhanteringen på grund av förlust under manipulation eller specialutrustning som krävs för att utföra utökad odling i 3D-sfäroider.
TV2D+-systemet kombinerar vanlig 2D-kultur med den livslängd och fenotypiska stabilitet som vanligtvis följer med 3D-system. Protokollet som beskrivs här ger steg-för-steg-anvisningar för användare med grundläggande vävnadsodlingskunskaper i laboratorier utrustade med standardutrustning som biosäkerhetsskåp, centrifuger och CO2 – inkubatorer. Varje steg i processen beskrivs i detalj, inklusive medieberedning, upptining, plätering och underhåll av det resulterande odlingssystemet. Protokollet innehåller också en metod för att bestämma grundläggande hepatocytfunktionalitet, albumin och urea, samt immunofluorescensbildanalys för bestämning av PHH-bindning för normalisering. När PHH:erna i TV2D+ etableras på rätt sätt organiserar de sig i hepatocytkolonier, efterliknar den naturliga levermorfologin och bibehåller förlängd livskraft, arkitektonisk integritet och fysiologiskt relevanta nivåer av albumin och urea i minst 2 veckor8. Eftersom systemet kan tillåta en rad PHH-såddtätheter kan det vara användbart för att öka tillgängligheten av mindre platebara PHH-partier som har önskvärda donatoregenskaper. Denna kombination av tillgänglighet och funktionalitet gör TV2D+ till en lämplig levermodell för en mängd olika farmakologiska och toxikologiska tillämpningar.
Det beskrivna leverodlingssystemet kan etableras i laboratorier som är utrustade med standardinstrument för vävnadsodling. Systemet består av PHH:er odlade med matarceller och gör det möjligt för användaren att odla PHH:er i minst två veckor med stabil albuminproduktion och ureasyntes. På grund av variationer i PHH-donatorpartier rekommenderas endast förscreenade och kvalificerade PHH:er för användning i systemet. Även om antalet bifogade PHH:er varierar beroende på donatorparti och såddtäthet, förblir den relativa plattbarheten likartad inom varje donatorparti. Även om rekommenderade såddtätheter rekommenderas, tyder ovanstående data på att hepatocytsåddstätheten kan justeras för olika experimentella behov; Det bör dock noteras att sådd av ett större antal PHH:er kanske inte ger högre eller mer konsekventa funktionella resultat. Analys av de utvärderade PHH-partierna visade den lägsta CV för albuminproduktion och ureasyntes med lägre sådddensiteter på 150 000 PHH/brunn och 200 000 PHH/brunn; Däremot hittades inga signifikanta skillnader mellan albumin och urea vid någon såddtäthet. Högre såddtätheter på 250 000 PHH/brunn och 300 000 PHH/brunn visar en större minskning av albumin och urea under den 14 dagar långa odlingsperioden. Donatorns inneboende variation i plateability kan påverka konsistensen i albuminproduktionen och ureasyntesen vid 250 000 PHH/brunn och 300 000 PHH/brunn för de testade donatorpartierna. I likhet med stora hepatocytsfäroider kan översådd av PHH:er i TV2D+-systemet ha negativa effekter på PHH:s långsiktiga odling och funktionalitet.
Alla steg i upptining, plätering och underhåll är avgörande för framgångsrik odling och datagenerering. Det finns dock flera vanliga misstag som oerfarna användare kan undvika. PHH är mycket känsliga för skador sekundärt till temperaturfluktuationer, skjuvspänning och exponering för luft 9,10. Försiktighetsåtgärder bör vidtas vid upptining av PHH för att undvika förlängda upptiningstider och överdriven pipettering. Användningen av en handhällningsmetod, en timer och omedelbar överföring från vattenbad till is kommer att minska dessa vanliga fel som kan påverka PHH:ernas livskraft och plattbarhet. Dessutom, med problem med leveranskedjan som blir vanligare, kan det vara svårt att få tag på kollagenbelagda plattor. Manuell beläggning av vävnadskulturbehandlade plattor med kommersiella lösningar av kollagen typ I (5-10 μg/cm2) kan användas för att lösa detta problem; För optimal prestanda och konsistens rekommenderas dock att använda förbelagda kollagenplattor. I processen för övergång från odling av enbart matarceller till införandet av PHH är det viktigt att förhindra att matarcellskiktet torkar. Låt aldrig matarcellerna utsättas för luft. All luftexponeringstid kan leda till dålig kvalitet på matarcellskiktet, vilket kommer att påverka den långsiktiga odlingen av PHH negativt. Det är bästa praxis att låta en liten mängd kvarvarande medium finnas kvar mellan mediebytena. Ibland kan PHH:er innehålla överflödigt skräp från isolering, vilket kan göra det svårt att se morfologin. För att hjälpa till med detta problem, skaka plattan före ett mediumbyte och använd vakuumaspiration. Slutligen, när du utför ett mediebyte, aspirera försiktigt det förbrukade mediet och var noga med att inte störa de odlade cellerna. Pipettera färsk medelvolym ner på sidan av brunnen för att undvika pipettering direkt på celskiktet. Användaren bör också undvika luftexponering vid varje mediebyte med hjälp av det rekommenderade bytet av 3 brunnar (avsnitt 3 och 4). Det bör också noteras att en daglig förändring av mediet är idealisk men inte nödvändig.
Även om fluorescerande mikroskop har blivit vanliga i de flesta laboratorier, kan programvara som behövs för att utföra specifik bildanalys medföra extra kostnader. ImageJ kan laddas ner gratis, vilket gör det till ett lättillgängligt bildanalysverktyg. Stegen i protokollet ger en grund som användaren kan behöva optimera, särskilt partikelanalys av DAPI-färgning; I avsaknad av fluorescerande avbildningsförmåga anges dock PHH-bindningsvärden på dag 14 på partispecifika analysintyg. Dålig tröskelvärde kommer att resultera i felaktig räkning av DAPI-partiklarna. Det rekommenderas också att kontrollera ytan på enskilda DAPI-partiklar innan du ställer in en storleksuteslutning. Detta kan uppnås genom att använda den ovala ikonen [Figur 2 (1), cirkelikonen under fliken Redigera ] och rita en cirkel som omfattar DAPI-partikeln. Fliken Analysera kan sedan användas för att mäta arean av den valda DAPI-partikeln. Specifika mätningar kan väljas med hjälp av Ställ in mått under fliken Analysera [steg 8.9 och figur 2 (4)].
Nuvarande metoder för att odla PHH involverar användning av beläggningar som kollagen-I för att öka cellbindningen i traditionell 2-dimensionell monokultur11 eller överlagring med en extracellulär matris, som den murinbaserade Matrigel, en teknik som vanligtvis kallas “sandwichkultur“12,13,14,15 . Även om sandwichodlingstekniken förbättrar PHH-morfologin och polariteten över tid jämfört med traditionell monokultur, saknar båda metoderna fortfarande långsiktig fenotypisk stabilitet i odlingen för de flesta plateable lots av PHH. En annan metod som används för att odla PHH är att göra 3D-sfäroider; Som tidigare konstaterats av Glicklis et al.4 kan det dock finnas tekniska utmaningar med reproducerbarheten av sfäroidstorlek på grund av donatorvariabilitet. I ett försök att göra en mer fysiologiskt relevant levermodell har flercelliga modeller utvecklats. Som beskrivits av Ware et al.7, med hjälp av mikromönstring, murina fibroblaster och primära humana sinusoida endotelceller omgivna av PHH möjliggjorde längre in vitro-odlingstider. Mikromönstring kan dock vara en komplex och tidskrävande process, och de icke-mänskliga matarcellerna kan bidra till bakgrund i metaboliska signaler, vilket begränsar användbarheten av denna plattform i vissa applikationer. Användningen av olika icke-leverceller, inklusive dermala fibroblaster från människa och råtta och endotelceller från bovina aorta som matningsceller för samodling av hepatocyter, har visat albuminutsöndring och bildandet av täta korsningar som liknar samodlingar av matarceller med leverursprung16. Mekanismen för interaktioner mellan TV2D+ icke-levermatarceller och PHH:erna i odling behöver dock undersökas ytterligare för att bättre förstå påverkan på stabiliteten och funktionaliteten hos PHH:erna i detta system. Odlingssystemet som tidigare beskrivits av Weaver et al.8 kan framgångsrikt odla PHH i leverkolonier i upp till 42 dagar och bilda omfattande gallkanalikulära nätverk. PHH:erna som odlades i detta system bibehöll viktiga leverfunktioner, inklusive cytokrom 1A2, 2B6 och 3A4-aktivitet och uridin 5′-difosfo-glukuronosyltransferas (UGT)-baserad enzymaktivitet, fas I- och II-metabolitbildning, albuminproduktion och ureasyntes i minst 22 dagar in vitro utan Matrigel. Detta odlingssystem producerar stabila, fysiologiskt relevanta resultat som lätt kan anpassas till alla laboratorier för farmakologiska och toxikologiska tillämpningar. Även om viktiga PHH-funktioner bibehålls i TV2D+-systemet har inga direkta jämförelser gjorts med 3D-sfäroidmodellen; Framtida arbete som jämför samma PHH-donatorer mellan odlingssystemen kommer dock att visa sig vara värdefullt för att bestämma gränserna och fördelarna med båda metoderna.
Potentiella tillämpningar av TV2D+ inkluderar utvärdering av metabolisk clearance och läkemedelsinteraktioner av substanser med låg omsättning, läkemedelsinducerad leverskada och riskbedömning av jordbrukskemikalier. Att korrekt förutsäga leverclearance av nya och framväxande läkemedel är beroende av en stabil och förlängd PHH-kultur med bibehållande av viktig hepatocellulär funktionalitet, vilket är särskilt utmanande vid utvärdering av substanser med låg omsättning. Dessutom är riskbedömning och kemiskt inducerad levertoxicitet stora hälsoproblem, och nuvarande modeller ger inte den långsiktiga stabilitet och funktionalitet i odling som krävs för att korrekt utvärdera potentiell kronisk kemisk toxicitet som kan vara sekundär till akut exponering. Friska och sjuka PHH:er odlade i TV2D+ uppvisade karakteristiska skillnader i funktion och lipiddisposition som bibehölls över tid17. Dessa studier stödjer TV2D+ som ett lovande verktyg för en rad olika farmakologiska och toxikologiska tillämpningar.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Mellissa Keller och Wendy Hetman för deras hjälp med manuskript och figurgranskning.
0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |