Bu protokolde, bir fare modelinde GC-MS kullanılarak BAT ile optimize edilmiş arteriyovenöz metabolomikler ile ilgili yöntemler özetlenmiştir. Bu yöntemler, organizma düzeyinde BAT aracılı metabolit değişimi hakkında değerli bilgiler edinilmesine izin verir.
Kahverengi yağ dokusu (BAT), titremeyen termojenez olarak bilinen benzersiz bir enerji harcama süreci yoluyla metabolik homeostazın düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Bunu başarmak için BAT, yüksek metabolik talebini desteklemek için dolaşımdaki besinlerden oluşan çeşitli bir menü kullanır. Ek olarak, BAT, metabolik yakıtlar veya sinyal molekülleri olarak hizmet edebilen metabolit kaynaklı biyoaktif faktörleri salgılar ve BAT aracılı doku içi ve/veya dokular arası iletişimi kolaylaştırır. Bu, BAT’ın keşfedilmeye başlanan ilginç bir özellik olan sistemik metabolit değişimine aktif olarak katıldığını göstermektedir. Burada, in vivo fare düzeyinde optimize edilmiş BAT arteriyovenöz metabolomikler için bir protokol sunuyoruz. Protokol, termojenik stimülasyonlar için ilgili yöntemlere ve interskapular BAT kaynaklı venöz kanı ve sistemik arteriyel kanı seçici olarak boşaltan Sulzer damarını kullanan bir arteriyovenöz kan örnekleme tekniğine odaklanmaktadır. Daha sonra, bu kan örneklerini kullanan bir gaz kromatografisi tabanlı metabolomik protokol gösterilmiştir. Bu tekniğin kullanımı, BAT tarafından metabolitlerin net alımını ve salınımını ölçerek organlar arası düzeyde BAT tarafından düzenlenen metabolit değişiminin anlaşılmasını genişletmelidir.
Kahverengi yağ dokusu (BAT), hem mitokondriyal ayrılmayan protein 1 (UCP1) bağımlı hem de UCP1’den bağımsız mekanizmaları 1,2,3,4,5 içeren, titremeyen termojenez (NST) olarak bilinen benzersiz bir enerji harcama özelliğine sahiptir. Bu ayırt edici özellikler, sistemik metabolizmanın düzenlenmesinde ve obezite, tip 2 diyabet, kardiyovasküler hastalık ve kanser kaşeksisi dahil olmak üzere metabolik hastalıkların patogenezinde BAT’ı içerir 6,7,8. Son retrospektif çalışmalar, insanlarda BAT kütlesi ve/veya metabolik aktivitesi ile obezite, hiperglisemi ve kardiyometabolik sağlık arasında ters bir ilişki olduğunu göstermiştir 9,10,11.
Son zamanlarda, BAT, termojenik yakıtolarak önemli miktarda dolaşımdaki besin maddesini gerektirdiğinden, NST’nin korunmasından sorumlu bir metabolik lavabo olarak önerilmiştir 6,7. Ayrıca BAT, endokrin ve/veya parakrin sinyaller olarak işlev gören kahverengi adipokinler veya BATokinler olarak adlandırılan biyoaktif faktörleri üretebilir ve serbest bırakabilir, bu da sistem düzeyinde metabolik homeostaza aktif katılımını gösterir 12,13,14,15. Bu nedenle, BAT’ın besin metabolizmasını anlamak, termoregülasyon organı olarak geleneksel rolünün ötesinde, insanlarda patofizyolojik önemi hakkındaki anlayışımızı geliştirmelidir.
Metabolize edilemeyen radyoizleyiciler kullanan klasik besin alım çalışmaları ile birlikte kararlı izotop izleyicileri kullanan metabolomik çalışmalar, hangi besin maddelerinin BAT tarafından tercihen alındığını ve nasıl kullanıldığını anlamamızı önemli ölçüde geliştirmiştir 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Örneğin, radyoaktif izleyici çalışmaları, soğukla aktive olan BAT’ın glikoz, lipoproteine bağlı yağ asitleri ve dallı zincirli amino asitleri aldığını göstermiştir 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Metabolomik çalışmalarla birleştirilen son izotop izleme, bu besinlerin dokular ve kültürlenmiş hücreler içindeki metabolik kaderini ve akışını ölçmemize izin verdi 24,25,26,28,29,30. Bununla birlikte, bu analizler öncelikle besinlerin bireysel kullanımına odaklanmakta ve bizi BAT’ın organ metabolit değişimindeki sistem düzeyindeki rolleri hakkında sınırlı bilgi bırakmaktadır. BAT tarafından tüketilen dolaşımdaki besinlerin spesifik serileri ve bunların karbon ve nitrojen açısından nicel katkıları ile ilgili sorular belirsizliğini korumaktadır. Ek olarak, BAT’ın besinleri kullanarak metabolit kaynaklı BATokinler (örneğin lipokinler) üretip salgılayamayacağının araştırılması daha yeni başlıyor 12,13,14,15,31,32.
Arteriyovenöz kan analizi, organlarda/dokularda dolaşan moleküllerin spesifik alımını veya salınımını değerlendirmek için kullanılan klasik bir fizyolojik yaklaşımdır. Bu teknik daha önce oksijen ve çeşitli metabolitleri ölçmek için sıçanların interskapular BAT’ına uygulanmış, böylece katabolik potansiyeli 33,34,35,36,37 ile BAT’ı adaptif termojenezin ana bölgesi olarak oluşturmuştur. Son zamanlarda, sıçan interskapular BAT kullanılarak yapılan bir arteriyovenöz çalışma, termojenik olarak uyarılmış BAT38 tarafından salınan keşfedilmemiş BATokinlerin tanımlanmasına yol açan bir trans-omik yaklaşımla birleştirildi.
Yüksek hassasiyetli gaz kromatografisi ve sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi (GC-MS ve LC-MS) tabanlı metabolomiklerdeki son gelişmeler, organa özgü metabolit değişiminin kantitatif analizi için arteriyovenöz çalışmalara olan ilgiyi yeniden alevlendirmiştir 39,40,41. Bu teknikler, yüksek çözme güçleri ve kütle doğrulukları ile, küçük numune miktarları kullanılarak çok çeşitli metabolitlerin kapsamlı analizini sağlar.
Bu gelişmelerle uyumlu olarak, yakın zamanda yapılan bir çalışma, arteriyovenöz metabolomikleri fare düzeyinde BAT’yi incelemek için başarıyla uyarladı ve farklı koşullar altında BAT’deki metabolit değişim aktivitelerinin kantitatif analizini sağladı42. Bu makale, bir C57BL/6J fare modelinde GC-MS kullanılarak BAT hedefli bir arteriyovenöz metabolomik protokol sunmaktadır.
BAT’ın tüm vücut enerji dengesindeki metabolik potansiyelini anlamanın kritik bir adımı, hangi besinleri tükettiğini, metabolik olarak nasıl işlendiğini ve dolaşıma hangi metabolitlerin salındığını tanımlamaktır. Bu protokol, yakın zamanda Park ve ark.42 tarafından geliştirilen ve onaylanan C57BL/6J farelerde interskapular BAT venöz vaskülatürüne ve sistemik arteriyel vaskülatüre erişim sağlayan özel bir arteriyovenöz örnekleme tekniğini tanıtmaktadır. Aşağı…
The authors have nothing to disclose.
Metodolojik tartışma için Choi ve Jung laboratuvarlarının tüm üyelerine teşekkür ederiz. Tavsiye ve geri bildirimleri için C. Jang ve D. Guertin’e teşekkür ederiz. Makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için M.S. Choi’ye teşekkür ederiz. Bu çalışma NRF-2022R1C1C1012034 tarafından S.M.J.’ye finanse edilmiştir; NRF-2022R1C1C1007023’ten DWC’ye; NRF-2022R1A4A3024551’den S.M.J. ve D.W.C.’ye Bu çalışma W.T.K. için Chungnam Ulusal Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 ve Şekil 2 BioRender (http://biorender.com/) kullanılarak oluşturulmuştur.
0.5-20 µL Filter Tips | Axygen | AX.TF-20-R-S | |
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) | Agilent | G7077B | |
Agilent 7693A Autosampler | Agilent | G4513A | |
Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
C57BL/6J mouse | DBL | C57BL/6JBomTac | |
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) | LABCONCO | 7811041 | |
DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
Eppendorf centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
Glass insert 250 μL | Agilent | 5181-1270 | |
Methanol (LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base | Sarstedt | 20.1290.100 | |
MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
Pyridine(anhydrous, 99.8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators | LABCONCO | 7310041 | |
Rodent diet | SAFE | SAFE R+40-10 | |
Rodent incubator | Power scientific | RIT33SD | |
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
Vial Cap 9 mm | Agilent | 5190-9067 | |
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |