Neste protocolo, métodos relevantes para metabolômica arteriovenosa otimizada para BAT usando GC-MS em um modelo de camundongo são descritos. Esses métodos permitem a aquisição de informações valiosas sobre a troca de metabólitos mediada por MTD em nível de organismo.
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Artigo de método
Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel crucial na regulação da homeostase metabólica através de um processo único de gasto energético conhecido como termogênese sem tremores. Para conseguir isso, a BAT utiliza um cardápio diversificado de nutrientes circulantes para suportar sua alta demanda metabólica. Além disso, a MTD secreta fatores bioativos derivados de metabólitos que podem servir como combustíveis metabólicos ou moléculas sinalizadoras, facilitando a comunicação intratecidual e/ou intertecidual mediada por BAT. Isso sugere que a MTD participa ativamente na troca de metabólitos sistêmicos, uma característica interessante que está começando a ser explorada. Aqui, apresentamos um protocolo para metbolômica arteriovenosa BAT otimizada em nível de camundongo in vivo . O protocolo se concentra em métodos relevantes para estimulações termogênicas e uma técnica de coleta de sangue arteriovenoso usando a veia de Sulzer, que drena seletivamente o sangue venoso interescapular derivado do BAT e o sangue arterial sistêmico. Em seguida, um protocolo metabolômico baseado em cromatografia gasosa usando essas amostras de sangue é demonstrado. O uso desta técnica deve expandir a compreensão da troca de metabólitos regulados por MTD em nível inter-órgão, medindo a captação líquida e liberação de metabólitos por BAT.
Introdução
O tecido adiposo marrom (BAT) possui uma propriedade única de gasto energético conhecida como termogênese sem tremores (NST), que envolve mecanismos dependentes da proteína desacopladora mitocondrial 1 (UCP1) e independentes de UCP1 1,2,3,4,5. Essas características distintas implicam MTD na regulação do metabolismo sistêmico e na patogênese de doenças metabólicas, incluindo obesidade, diabetes tipo 2, doença cardiovascular e caquexia por câncer 6,7,8<....
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Protocolo
Todos os experimentos foram conduzidos com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sungkyunkwan (IACUC). Os camundongos foram alojados em um biotério aprovado pela IACUC, localizado em uma sala limpa regulada para 22 °C e 45% de umidade, após um ciclo claro/escuro diário de 12 horas. Eles foram mantidos em racks ventilados e tiveram acesso a uma dieta padrão de ração ad libitum (composta por 60% de carboidratos, 16% de proteínas e 3% de gorduras). Os materiais de cama e nidificação foram trocados semanalmente. Para este estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J com idade de 12 semanas e peso entre 25 g e 30 g. Est....
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Resultados
A Figura 1 ilustra o esquema experimental da metabolômica AV otimizada para BAT. Como mencionado na seção Protocolo, para obter tecido adiposo marrom diferencialmente estimulado, camundongos são submetidos à aclimatação à temperatura em incubadoras de roedores ou recebem administração farmacológica, como agonistas de receptores β-adrenérgicos. Posteriormente, camundongos são anestesiados e amostras de sangue são coletadas para análise metabolômica (Figura 1A). P.......
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Discussão
Um passo crítico na compreensão do potencial metabólico da MTD no balanço energético de todo o corpo é definir quais nutrientes ela consome, como eles são processados metabolicamente e quais metabólitos são liberados na circulação. Esse protocolo introduz uma técnica especializada em amostragem arteriovenosa que permite o acesso à vasculatura venosa das MTD interescapulares e da vasculatura arterial sistêmica em camundongos C57BL/6J, recentemente desenvolvida e validada por Park ecols.42. Abaixo e.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os membros dos laboratórios Choi e Jung pela discussão metodológica. Agradecemos a C. Jang e D. Guertin pelos conselhos e feedback. Agradecemos a M.S. Choi pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por NRF-2022R1C1C1012034 para S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 para D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 para S.M.J. e D.W.C. Este trabalho foi apoiado pela Chungnam National University for W.T.K. A Figura 1 e a Figura 2 foram criadas usando BioRender (http://biorender.com/).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5-20 µ L Pontas de Filtro | Axygen | AX. TF-20-R-S | |
| Seringa de 1 mL com agulha acoplada - 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
| Agilent 5977B GC/MSD (detector seletivo de massa) | Agilent | G7077B | |
| Agilent 7693A Amostrador automático | Agilent | G4513A | |
| Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
| Agilent J& W Coluna GC (Coluna Capilar) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent MassHunter Workstation software_MS Análise quantitativa (Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
| C57BL / 6J mouse | DBL | C57BL / 6JBomTac | |
| CentriVap -50 ° C Armadilha Fria (com Tampa de Aço Inoxidável) | LABCONCO | ||
| DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
| Centrífuga Eppendorf 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Inserção de vidro 250 μ L | Agilent | 5181-1270 | |
| Metanol (grau LC-MS) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
| Cloridrato de metoxiamina | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
| Microvette 200 Sérum, 200 µ L, tampa vermelha, base plana | Sarstedt | 20.1290.100 | |
| MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
| Piridina(anidra, 99,8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
| Concentradores de Vácuo Completos CentriVap Refrigerados | LABCONCO | ||
| Dieta para roedores | SAFE | SAFE R+40-10 | |
| Incubadora de roedores | Power scientific | RIT33SD | |
| Agulhas de caneta ultrafinas - 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
| mm | Agilent | 5190-9067 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |
Referências
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling ....
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Reimpressões e permissões
