이 프로토콜에서는 마우스 모델에서 GC-MS를 사용하는 BAT에 최적화된 동정맥 대사체학과 관련된 방법을 간략하게 설명합니다. 이러한 방법을 통해 유기체 수준에서 BAT 매개 대사 산물 교환에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
갈색 지방 조직(BAT)은 비떨림 열발생으로 알려진 독특한 에너지 소비 과정을 통해 대사 항상성을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이를 위해 BAT는 높은 신진대사 수요를 지원하기 위해 다양한 순환 영양소 메뉴를 활용합니다. 또한 BAT는 대사 연료 또는 신호 분자 역할을 할 수 있는 대사 산물 유래 생체 활성 인자를 분비하여 BAT에 의해 매개 조직 내 및/또는 조직 간 통신을 촉진합니다. 이는 BAT가 전신 대사 산물 교환에 적극적으로 참여한다는 것을 시사하며, 이는 이제 연구되기 시작한 흥미로운 특징입니다. 여기에서는 생체 내 마우스 수준에 최적화된 BAT 동정맥 대사체학을 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜은 견갑간 BAT 유래 정맥혈과 전신 동맥혈을 선택적으로 배출하는 Sulzer 정맥을 사용하는 동정맥 혈액 샘플링 기술과 열발생 자극을 위한 관련 방법에 중점을 둡니다. 다음으로, 이러한 혈액 샘플을 사용하는 가스 크로마토그래피 기반 대사체학 프로토콜을 시연합니다. 이 기법을 사용하면 BAT에 의한 대사 산물의 순 흡수 및 방출을 측정하여 장기 간 수준에서 BAT 조절 대사 산물 교환에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다.
갈색 지방 조직(BAT)은 미토콘드리아 분리 단백질 1(UCP1) 의존성 및 UCP1 독립적 메커니즘 1,2,3,4,5를 모두 포함하는 비떨림 열발생(NST)으로 알려진 고유한 에너지 소비 특성을 가지고 있습니다. 이러한 특징은 BAT가 전신 대사 조절과 비만, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환 및 암 악액질을 포함한 대사 질환의 발병기전을 암시합니다 6,7,8. 최근의 후향적 연구는 BAT 질량 및/또는 그 대사 활동과 인간의 비만, 고혈당증 및 심장 대사 건강 사이의 반비례 관계를 보여주었습니다 9,10,11.
최근 BAT는 발열 연료로서 상당한 양의 순환 영양소를 필요로 하기 때문에 NST를 유지하는 대사 싱크로 제안되었습니다 6,7. 또한, BAT는 내분비 및/또는 부분비 신호로 작용하는 갈색 아디포카인 또는 BATokine이라고 하는 생체 활성 인자를 생성 및 방출할 수 있으며, 이는 시스템 수준의 대사 항상성에 적극적으로 관여함을 나타냅니다 12,13,14,15. 따라서 BAT의 영양 대사를 이해하면 체온 조절 기관으로서의 전통적인 역할을 넘어 인간에 대한 병태생리학적 중요성에 대한 이해가 향상될 것입니다.
비대사성 방사성 추적자를 사용하는 고전적인 영양소 흡수 연구와 안정 동위원소 추적자를 사용하는 대사체 연구는 BAT가 우선적으로 어떤 영양소를 흡수하고 어떻게 활용하는지에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 예를 들어, 방사성 추적자 연구는 저온 활성 BAT가 포도당, 지단백질 결합 지방산 및 분지 사슬 아미노산 16,17,18,19,20,21,22,23,27을 흡수한다는 것을 입증했습니다. 대사체 연구와 결합된 최근의 동위원소 추적을 통해 조직 및 배양 세포 내에서 이러한 영양소의 대사 운명과 흐름을 측정할 수 있게 되었습니다 24,25,26,28,29,30. 그러나 이러한 분석은 주로 영양소의 개별 활용에 초점을 맞추기 때문에 장기 대사 산물 교환에서 BAT의 시스템 수준 역할에 대한 지식은 제한적입니다. BAT가 소비하는 특정 순환 영양소와 탄소 및 질소 측면에서 양적 기여도에 대한 질문은 여전히 파악하기 어렵습니다. 또한, BAT가 영양소를 사용하여 대사 산물 유래 BATokine(예: 리포카인)을 생성 및 방출할 수 있는지에 대한 탐구는 이제 막 시작되었습니다 12,13,14,15,31,32.
동정맥혈 분석은 장기/조직에서 순환 분자의 특정 흡수 또는 방출을 평가하는 데 사용되는 고전적인 생리학적 접근 방식입니다. 이 기술은 이전에 산소와 여러 대사 산물을 측정하기 위해 쥐의 견갑골 간 BAT에 적용되어 BAT를 이화 전위 33,34,35,36,37을 가진 적응 열 발생의 주요 부위로 설정했습니다. 최근 쥐의 견갑간 BAT를 사용한 동정맥 연구는 트랜스오믹스 접근법과 결합되어 열발생 자극 BAT38에 의해 방출되는 발견되지 않은 BATokine을 식별했습니다.
최근 고감도 가스 크로마토그래피 및 액체 크로마토그래피 질량분석법(GC-MS 및 LC-MS) 기반 대사체학의 발전으로 장기 특이적 대사산물 교환의 정량 분석을 위한 동정맥 연구에 대한 관심이 다시 높아졌습니다 39,40,41. 이러한 기술은 높은 분해능과 질량 정확도를 통해 소량의 시료를 사용하여 광범위한 대사 산물을 포괄적으로 분석할 수 있습니다.
이러한 발전에 발맞추어, 최근의 한 연구는 쥐 수준에서 BAT를 연구하기 위해 동정맥 대사체학을 성공적으로 채택하여, 다양한 조건 하에서 BAT의 대사체 교환 활성에 대한 정량적 분석을 가능하게 했다42. 이 기사에서는 C57BL/6J 마우스 모델에서 GC-MS를 사용하는 BAT 표적 동정맥 대사체학 프로토콜을 제시합니다.
전신 에너지 균형에서 BAT의 대사 잠재력을 이해하는 데 중요한 단계는 BAT가 소비하는 영양소, 대사 처리 방법, 순환계로 방출되는 대사 산물을 정의하는 것입니다. 이 프로토콜은 C57BL/6J 마우스에서 견갑간 BAT의 정맥 혈관 및 전신 동맥 혈관에 접근할 수 있는 특수 동정맥 샘플링 기술을 도입하며, 이는 최근 Park etal 42에 의해 개발 및 검증되었습니다. 다음은 프로토콜을 따를 때 ?…
The authors have nothing to disclose.
방법론적 논의를 해주신 최 및 정 연구실 모든 분들께 감사드립니다. 조언과 피드백을 주신 C. Jang과 D. Guertin에게 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽어주신 M.S. Choi에게 감사드립니다. 이 작업은 NRF-2022R1C1C1012034에서 SMJ에 자금을 지원했습니다. NRF-2022R1C1C1007023에서 DWC로; NRF-2022R1A4A3024551 – S.M.J. 및 DWC 이 연구는 충남대학교의 지원을 받아 진행되었으며, 그림 1과 그림 2는 BioRender(http://biorender.com/)를 이용하여 제작되었다.
0.5-20 µL Filter Tips | Axygen | AX.TF-20-R-S | |
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) | Agilent | G7077B | |
Agilent 7693A Autosampler | Agilent | G4513A | |
Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
C57BL/6J mouse | DBL | C57BL/6JBomTac | |
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) | LABCONCO | 7811041 | |
DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
Eppendorf centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
Glass insert 250 μL | Agilent | 5181-1270 | |
Methanol (LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base | Sarstedt | 20.1290.100 | |
MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
Pyridine(anhydrous, 99.8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators | LABCONCO | 7310041 | |
Rodent diet | SAFE | SAFE R+40-10 | |
Rodent incubator | Power scientific | RIT33SD | |
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
Vial Cap 9 mm | Agilent | 5190-9067 | |
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |