Ein magnetabscheidungsunterstütztes Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsverfahren für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Vesikeln
Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir eine magnetische Separations-gestützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Produktion von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimikern (EMs), die den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur, Morphologie und Proteinzusammensetzung von nativen extrazellulären Vesikeln (EVs) aufweisen.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) haben in der physiologischen und pathologischen Forschung, Krankheitsdiagnose und -behandlung große Aufmerksamkeit erregt. Ihre klinische Umsetzung wurde jedoch durch das Fehlen von Scale-up-Fertigungsansätzen eingeschränkt. Daher bietet dieses Protokoll eine magnetische Separations-unterstützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimiks (EMs), die von den Endosomen abgeleitet sind und eine etwa 100-mal höhere Ausbeute als die herkömmliche Ultrazentrifugationsmethode aufweisen. Bei dieser Methode wurden magnetische Nanopartikel (MNPs) von den Elternzellen mittels Endozytose internalisiert und anschließend in ihren Endosomen akkumuliert. Anschließend wurden MNPs-beladene Endosomen gesammelt und durch hypotone Behandlung und magnetische Trennung gereinigt. Ein Hochgeschwindigkeits-Homogenisator wurde verwendet, um MNP-beladene Endosomen in monodisperse Nanovesikel zu zerlegen. Die resultierenden Endosomen-abgeleiteten Vesikel weisen den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur auf, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, Transmissionselektronenmikroskop und Western Blot gekennzeichnet sind. Ihre Morphologie und Proteinzusammensetzung ähneln nativen EVs, was darauf hindeutet, dass EMs möglicherweise als kostengünstiger und ertragreicher Ersatz für native EVs für klinische Translationen dienen können.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind kleine Vesikel, die von fast allen Zellen mit einem Größenbereich von 30-150 nm abgesondert werden und reichlich bioaktive Substanzen enthalten. Abhängig von der Ursprungszelle weisen EVs eine hohe Heterogenität auf und besitzen mehrere Komponenten, die spezifisch für Elternzellensind 1. EVs werden in Körperflüssigkeiten freigesetzt und an entfernte Orte transportiert, wo sie von Zielzellen für Aktion2 aufgenommen werden, die zur Verabreichung einer breiten Palette von bioaktiven Molekülen und Medikamenten für die Gewebereparatur, die Tumordiagnose und -behandlung sowie die Immunmodulation verwendet werdenkönnen 3,4. Andere biologische Nanopartikel (z. B. Lipoproteine) und Nanovesikel (z. B. EVs, die aus nicht-endosomalen Signalwegen stammen) mit ähnlichen biophysikalischen Eigenschaften in Körperflüssigkeiten beeinflussen jedoch unweigerlich die Isolierung und Reinigung von EV. Bis heute ist die Ultrazentrifugation der Goldstandard für die Isolierung von Elektrofahrzeugen, und es wurden andere Isolationsmethoden entwickelt, darunter Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Ultrafiltration, Polyethylenglykolfällung, Chromatographie und immunmagnetische Bead-Isolierung5. Der derzeitige Engpass, der die klinische Translation und Kommerzialisierung von EV-Therapeutika einschränkt, ist der gravierende Mangel an Isolationstechniken, die eine hochgradig skalierbare und reproduzierbare Isolierung von EVs ermöglichen 6,7,8. Herkömmliche EV-Isolationstechniken (z. B. Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie) leiden unter einer geringen Ausbeute (1 x 107-1 x 108/1 x 106 Zellen), einem langen Produktionszyklus (24-48 h), einer schlechten Reproduzierbarkeit der Produktqualität und erfordern teure und energieintensive Produktionsanlagen, die die derzeitige klinische Nachfrage nach Elektrofahrzeugen nicht deckenkönnen 6.
Exosomen-Mimics (EMs), synthetische Surrogate nativer Elektrofahrzeuge, haben aufgrund ihrer sehr ähnlichen Struktur, Funktion und Skalierbarkeit in der Produktion große Aufmerksamkeit erregt. Die Hauptquelle für EMs ist die direkte Extrusion ganzer Elternzellen mit kontinuierlicher Sektion9,10, was starke biologische Funktionen als native EVs zeigt11,12. Zum Beispiel üben EMs, die aus mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur (hUCMSCs) gewonnen werden, ähnliche Wundheilungseffekte aus wie native EVs und sind reicher in der Proteinzusammensetzung13. Obwohl EMs, die aus ganzen Zellen gewonnen werden, die biologische Komplexität von EVs aufweisen, ist ihr Hauptnachteil die Heterogenität der Produkte, da sie unweigerlich durch verschiedene Zellorganellen und Zelltrümmer kontaminiert werden. Die Analyse der Proteinlokalisierung ergab außerdem, dass EMs, die aus der Ganzzellextrusion stammen, viele nicht-EVs-spezifische Proteine aus Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum enthalten13. Darüber hinaus erfordern die meisten Verfahren zur Herstellung von EMs immer noch eine Ultrazentrifugation, ein sehr zeit- und energieaufwändiger Prozess14. In Anbetracht der Tatsache, dass Exosomen ausschließlich von zellulären Endosomen abgeleitet werden, stellten wir die Hypothese auf, dass biotechnologisch hergestellte Endosomen-abgeleitete Nanovesikel die biologische Homologie zwischen Exosomen und EMs besser rekapitulieren können als die etablierten EMs aus der Zellmembran, die durch die Ganzzellextrusionsmethode hergestellt werden14. Dennoch ist die Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln aufgrund des Mangels an praktikablen Ansätzen schwierig.
Klinische Studien wurden durchgeführt, indem EVs als Surrogat für eine zellfreie Therapie und als nanoskaliges Arzneimittelverabreichungssystem für die Behandlung verschiedener Krankheiten verwendet wurden. So wurden beispielsweise aus mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks gewonnene EVs zur Behandlung schwerer Lungenentzündungen eingesetzt, die durch COVID-19 verursacht wurden, und haben vielversprechende Ergebnisse erzielt. In jüngster Zeit haben gentechnisch veränderte Elektrofahrzeuge, die CD24-Proteine tragen, auch einen starken therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von COVID-19-Patienten gezeigt15,16. Der klinische Bedarf der EV-Therapie kann jedoch aufgrund der geringen Ausbeute und Kosten immer noch nicht mit herkömmlichen Isolationsmethoden erfüllt werden. Diese Studie berichtet über die großtechnische Produktion von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln über einen magnetabscheidungsunterstützten Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsansatz. Es nutzt den Endozytoseweg von MNPs, um MNP-beladene Endosomen durch magnetische Trennung zu isolieren, gefolgt von einer Hochgeschwindigkeitshomogenisierung, um Endosomen zu monodispersen Nanovesikeln zu formulieren. Da die Arten von Endosomen, die von diesem Protokoll gesammelt werden, vielfältig sind, ist noch weitere eingehende Forschung erforderlich, um gute Herstellungspraktiken (GMP) in der Industrie zu etablieren. Dieser neuartige EM-Präparationsansatz ist zeiteffizienter (5 Minuten Hochgeschwindigkeitshomogenisierung), um Nanovesikel zu erhalten, die homolog zu nativen EVs sind. Es produziert exponentiell mehr Vesikel aus der gleichen Anzahl von Zellen als die Ultrazentrifugation, die im Allgemeinen auf verschiedene Zelltypen angewendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als Surrogat der zellfreien Therapie und eines nanoskaligen Arzneimittelverabreichungssystems müssen EVs ihre klinischen Erwartungen noch erfüllen, und ein Haupthindernis ist der Mangel an skalierbaren und reproduzierbaren Produktions- und Reinigungsmethoden6. Daher wurden verschiedene Arten von EMs als EV-Analoga mit ähnlicher biologischer Komplexität entwickelt14. Das bisher am häufigsten verwendete EM-Beispiel sind Nanovesikel aus Zellplasmamembranen. Die Herstellun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen den Einsatz von Instrumenten in der Shared Instrumentation Core Facility am Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC) der Chinesischen Akademie der Wissenschaften. Diese Studie wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), der Natural Science Foundation of Zhejiang Province, China (LZ22H310001), dem 551 Health Talent Training Project der Gesundheitskommission der Provinz Zhejiang, China, dem Agricultural and Social Development Research Project des Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau (2022ZDSJ0474) und dem Qiantang Interdisciplinary Research Grant.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
Referências
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