एंडोसोम-व्युत्पन्न पुटिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक चुंबकीय पृथक्करण-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता विधि
Summary
यहां, हम एंडोसोम-व्युत्पन्न नैनोवेसिकल्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक चुंबकीय पृथक्करण-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता विधि का वर्णन एक नए प्रकार के एक्सोसोम मिमिक्स (ईएम) के रूप में करते हैं जो एक ही जैविक उत्पत्ति और समान संरचना, आकृति विज्ञान और प्रोटीन संरचना साझा करते हैं।
Abstract
बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) ने शारीरिक और रोग अनुसंधान, रोग निदान और उपचार में महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है; हालांकि, उनके नैदानिक अनुवाद को स्केल-अप विनिर्माण दृष्टिकोणों की कमी से सीमित किया गया है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल एंडोसोम से प्राप्त एक नए प्रकार के एक्सोसोम मिमिक्स (ईएम) के रूप में एंडोसोम-व्युत्पन्न नैनोवेसिकल्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक चुंबकीय पृथक्करण-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता विधि प्रदान करता है, जिसमें पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधि की तुलना में लगभग 100 गुना अधिक उपज होती है। इस पद्धति में, चुंबकीय नैनोकणों (एमएनपी) को एंडोसाइटोसिस के माध्यम से पैतृक कोशिकाओं द्वारा आंतरिक किया गया था और बाद में उनके एंडोसोम के भीतर जमा किया गया था। फिर, एमएनपी-लोडेड एंडोसोम को हाइपोटोनिक उपचार और चुंबकीय पृथक्करण द्वारा एकत्र और शुद्ध किया गया। एमएनपी-लोडेड एंडोसोम को मोनोडिस्पर्स नैनोवेसिकल्स में तोड़ने के लिए एक उच्च गति वाले होमोजेनाइज़र का उपयोग किया गया था। परिणामी एंडोसोम-व्युत्पन्न पुटिकाओं में एक ही जैविक उत्पत्ति और संरचना होती है, जो नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप और पश्चिमी सोख्ता की विशेषता है। उनकी आकृति विज्ञान और प्रोटीन संरचना देशी ईवीएस के समान है, यह दर्शाता है कि ईएम संभावित रूप से नैदानिक अनुवाद के लिए देशी ईवीएस के कम लागत और उच्च उपज वाले सरोगेट के रूप में काम कर सकते हैं।
Introduction
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) 30-150 एनएम के आकार की सीमा के साथ लगभग सभी कोशिकाओं द्वारा स्रावित छोटे पुटिका होते हैं, जिनमें प्रचुर मात्रा में बायोएक्टिव पदार्थ होते हैं। उत्पत्ति की कोशिका के आधार पर, ईवीएस उच्च विषमता दिखाते हैं, जिसमें मूल कोशिकाओं के लिए विशिष्ट कई घटकहोते हैं 1. ईवीएस को शरीर के तरल पदार्थ में छोड़ा जाता है और दूर की साइटों पर ले जाया जाता है जहां उन्हें कार्रवाई2 के लिए लक्ष्य कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, जिसका उपयोग ऊतक की मरम्मत, ट्यूमर निदान और उपचार, और प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन 3,4 के लिए बायोएक्टिव अणुओं और दवाओं की एक विस्तृत श्रृंखला देने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, शरीर के तरल पदार्थों में समान बायोफिजिकल गुणों के साथ अन्य जैविक नैनोकणों (जैसे, लिपोप्रोटीन) और नैनोवेसिकल्स (जैसे, गैर-एंडोसोमल मार्गों से प्राप्त ईवीएस) अनिवार्य रूप से ईवी अलगाव और शुद्धि को प्रभावित करते हैं। तिथि करने के लिए, ultracentrifugation ईवी अलगाव के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई है, और अन्य अलगाव विधियों, sucrose घनत्व ढाल centrifugation, ultrafiltration, polyethylene ग्लाइकोल वर्षा, क्रोमैटोग्राफी, और immunomagnetic मनका अलगाव सहित,5 विकसित किया गया है. ईवी चिकित्सा विज्ञान के नैदानिक अनुवाद और व्यावसायीकरण को सीमित करने वाली वर्तमान अड़चन अलगाव तकनीकों की गंभीर कमी है जो ईवीएस 6,7,8 के अत्यधिक स्केलेबल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव की अनुमति देती है। पारंपरिक ईवी अलगाव तकनीक (जैसे, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी) कम उपज (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 कोशिकाओं), लंबे उत्पादन चक्र (24-48 एच), उत्पाद की गुणवत्ता की खराब प्रजनन क्षमता, और महंगी और ऊर्जा-गहन उत्पादन उपकरण की आवश्यकता होती है जो ईवीएस6 के लिए वर्तमान नैदानिक मांग को पूरा नहीं कर सकते हैं।
एक्सोसोम मिमिक्स (ईएम), देशी ईवी के सिंथेटिक सरोगेट, ने उत्पादन में उनकी अत्यधिक समान संरचना, कार्य और मापनीयता के कारण महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है। ईएम का मुख्य स्रोत निरंतर सेक्शनिंग 9,10 के साथ पूरे पैतृक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष एक्सट्रूज़न से है, जो देशी ईवीएस11,12 के रूप में शक्तिशाली जैविक कार्यों का प्रदर्शन करता है। उदाहरण के लिए, मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम सेल (hUCMSCs) से व्युत्पन्न EMs देशी EVs के रूप में इसी तरह घाव भरने प्रभाव डालती है और प्रोटीन संरचना13 में अमीर हैं. हालांकि पूरे कोशिकाओं से प्राप्त ईएम में ईवीएस की जैविक जटिलता होती है, लेकिन उनका मुख्य दोष उत्पादों की विषमता है क्योंकि वे अनिवार्य रूप से विभिन्न सेलुलर ऑर्गेनेल और सेल मलबे से दूषित होते हैं। प्रोटीन स्थानीयकरण विश्लेषण आगे पता चला है कि पूरे सेल बाहर निकालना से व्युत्पन्न ईएम माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम13 से कई गैर ईवीएस-विशिष्ट प्रोटीन होते हैं. इसके अलावा, ईएम के निर्माण के लिए अधिकांश तरीकों को अभी भी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, एक अत्यधिक समय और ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया14 की आवश्यकता होती है। तथ्य यह है कि exosomes विशेष रूप से सेलुलर endosomes से व्युत्पन्न कर रहे हैं को ध्यान में रखते हुए, हम bioengineered endosome-व्युत्पन्न nanovesicles बेहतर अच्छी तरह से स्थापित सेल झिल्ली व्युत्पन्न पूरे सेल बाहर निकालना विधि14 द्वारा उत्पादित EMs के साथ तुलना में exosomes और ईएम के बीच जैविक होमोलॉजी recapitulate हो सकता है कि परिकल्पना. फिर भी, व्यवहार्य दृष्टिकोणों की कमी के कारण एंडोसोम-व्युत्पन्न नैनोवेसिकल्स का निर्माण मुश्किल है।
विभिन्न रोगों के उपचार के लिए सेल-फ्री थेरेपी और नैनोस्केल ड्रग डिलीवरी सिस्टम के सरोगेट के रूप में ईवीएस का उपयोग करके नैदानिक अध्ययन किए गए हैं। उदाहरण के लिए, अस्थि मज्जा मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त ईवीएस का उपयोग COVID-19 के कारण होने वाले गंभीर निमोनिया के इलाज के लिए किया गया है और आशाजनक परिणाम प्राप्त किए हैं। हाल ही में, सीडी 24 प्रोटीन ले जाने वाले आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ईवी ने भी COVID-19 रोगियों के इलाज के लिए शक्तिशाली चिकित्सीय लाभ प्रदर्शित किए हैं15,16. हालांकि, कम उपज और लागत के कारण ईवी थेरेपी की नैदानिक आवश्यकता को अभी भी पारंपरिक अलगाव विधियों से पूरा नहीं किया जा सकता है। यह अध्ययन एक चुंबकीय पृथक्करण-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता दृष्टिकोण के माध्यम से एंडोसोम-व्युत्पन्न नैनोवेसिकल्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन की रिपोर्ट करता है। यह चुंबकीय पृथक्करण के माध्यम से एमएनपी-लोडेड एंडोसोम को अलग करने के लिए एमएनपी के एंडोसाइटोसिस मार्ग का लाभ उठाता है, इसके बाद मोनोडिस्पर्स नैनोवेसिकल्स में एंडोसोम तैयार करने के लिए उच्च गति समरूपता होती है। चूंकि इस प्रोटोकॉल द्वारा एकत्र किए गए एंडोसोम के प्रकार विविध हैं, इसलिए उद्योग में अच्छी विनिर्माण प्रथाओं (जीएमपी) को स्थापित करने के लिए अभी भी गहन शोध की आवश्यकता है। यह उपन्यास ईएम तैयारी दृष्टिकोण देशी ईवीएस के लिए समरूप नैनोवेसिकल्स प्राप्त करने के लिए अधिक समय कुशल (उच्च गति समरूपता के 5 मिनट) है। यह अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में कोशिकाओं की समान मात्रा से तेजी से अधिक पुटिकाओं का उत्पादन करता है, जिसे आम तौर पर विभिन्न सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल-फ्री थेरेपी और एक नैनोस्केल ड्रग डिलीवरी सिस्टम के सरोगेट के रूप में, ईवीएस ने अभी तक अपनी नैदानिक अपेक्षाओं को पूरा नहीं किया है, और एक मुख्य बाधा स्केलेबल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उत्पाद?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इंस्टीट्यूट ऑफ बेसिक मेडिसिन एंड कैंसर (आईबीएमसी), चीनी एकेडमी ऑफ साइंसेज में साझा इंस्ट्रूमेंटेशन कोर सुविधा में उपकरणों के उपयोग को स्वीकार करते हैं। इस अध्ययन को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (NSFC; 82172598), झेजियांग प्रांत, चीन (LZ22H310001) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, झेजियांग प्रांत, चीन के स्वास्थ्य आयोग की 551 स्वास्थ्य प्रतिभा प्रशिक्षण परियोजना, हांग्जो नगर विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो की कृषि और सामाजिक विकास अनुसंधान परियोजना (2022ZDSJ0474) और कियानतांग अंतःविषय अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
Referências
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