Un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de vesículas derivadas de endosomas
Summary
Aquí, describimos un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) que comparten el mismo origen biológico y una estructura, morfología y composición proteica similares de las vesículas extracelulares (EV) nativas.
Abstract
Las vesículas extracelulares (VE) han atraído una atención significativa en la investigación fisiológica y patológica, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades; Sin embargo, su traslación clínica se ha visto limitada por la falta de enfoques de fabricación a escala. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) derivados de los endosomas, que tienen un rendimiento aproximadamente 100 veces mayor que el método de ultracentrifugación convencional. En este método, las nanopartículas magnéticas (MNP) fueron internalizadas por las células parentales a través de la endocitosis y posteriormente se acumularon dentro de sus endosomas. A continuación, se recogieron los endosomas cargados de MNPs y se purificaron mediante tratamiento hipotónico y separación magnética. Se utilizó un homogeneizador de alta velocidad para romper los endosomas cargados con MNP en nanovesículas monodispersas. Las vesículas derivadas del endosoma resultantes presentan el mismo origen biológico y estructura, caracterizadas por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el microscopio electrónico de transmisión y la transferencia occidental. Su morfología y composición proteica son similares a las de los VE nativos, lo que indica que los ME pueden servir potencialmente como un sustituto de bajo costo y alto rendimiento de los VE nativos para traducciones clínicas.
Introduction
Las vesículas extracelulares (VE) son pequeñas vesículas secretadas por casi todas las células con un rango de tamaño de 30-150 nm, que contienen abundantes sustancias bioactivas. Dependiendo de la célula de origen, las VE muestran una alta heterogeneidad, poseyendo múltiples componentes específicos de las células parentales1. Las VE se liberan en los fluidos corporales y se transportan a sitios distantes donde son absorbidas por las células diana para la acción2, que se puede utilizar para administrar una amplia gama de moléculas bioactivas y fármacos para la reparación de tejidos, el diagnóstico y tratamiento de tumores y la modulación inmunitaria 3,4. Sin embargo, otras nanopartículas biológicas (p. ej., lipoproteínas) y nanovesículas (p. ej., VE derivadas de vías no endosomales) con propiedades biofísicas similares en los fluidos corporales afectan inevitablemente al aislamiento y la purificación de las VE. Hasta la fecha, la ultracentrifugación sigue siendo el estándar de oro para el aislamiento de EV, y se han desarrollado otros métodos de aislamiento, incluida la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, la ultrafiltración, la precipitación de polietilenglicol, la cromatografía y el aislamiento inmunomagnético de perlas5. El cuello de botella actual que limita la traslación clínica y la comercialización de las terapias con VE es la grave falta de técnicas de aislamiento que permitan el aislamiento altamente escalable y reproducible de las VE 6,7,8. Las técnicas tradicionales de aislamiento de VE (p. ej., ultracentrifugación y cromatografía de exclusión por tamaño) adolecen de bajo rendimiento (1 x 107-1 x 108/1 x 106 células), largo ciclo de producción (24-48 h), escasa reproducibilidad de la calidad del producto y requieren equipos de producción caros y que consumen mucha energía y no pueden satisfacer la demanda clínica actual de VE6.
Los imitadores de exosomas (EM), sustitutos sintéticos de los EV nativos, han atraído una atención importante debido a su estructura, función y escalabilidad altamente similares en la producción. La principal fuente de EM proviene de la extrusión directa de células parentales enteras con seccionamiento continuo 9,10, demostrando potentes funciones biológicas como EV nativas11,12. Por ejemplo, las ME derivadas de células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (hUCMSC) ejercen efectos de cicatrización de heridas similares a los de las VE nativas y son más ricas en composición proteica13. Aunque los ME derivados de células enteras tienen la complejidad biológica de los VE, su principal inconveniente es la heterogeneidad de los productos, ya que están inevitablemente contaminados por varios orgánulos celulares y restos celulares. El análisis de localización de proteínas reveló además que las ME derivadas de la extrusión de células enteras contienen muchas proteínas no específicas de las VE de las mitocondrias y del retículo endoplásmico13. Además, la mayoría de los métodos de fabricación de EM siguen requiriendo la ultracentrifugación, un proceso que consume mucho tiempo y energía14. Teniendo en cuenta el hecho de que los exosomas se derivan exclusivamente de endosomas celulares, planteamos la hipótesis de que las nanovesículas derivadas de endosomas de bioingeniería pueden recapitular mejor la homología biológica entre exosomas y EM en comparación con los EM derivados de la membrana celular bien establecidos producidos por el método de extrusión de células completas14. Sin embargo, la fabricación de nanovesículas derivadas de endosomas es difícil debido a la falta de enfoques viables.
Se han llevado a cabo estudios clínicos utilizando VE como sustituto de la terapia libre de células y un sistema de administración de fármacos a nanoescala para el tratamiento de diversas enfermedades. Por ejemplo, las VE derivadas de células madre mesenquimales de la médula ósea se han utilizado para tratar la neumonía grave causada por la COVID-19 y han logrado resultados prometedores. Recientemente, los VE modificados genéticamente que transportan proteínas CD24 también han demostrado potentes beneficios terapéuticos para el tratamiento de pacientes con COVID-1915,16. Sin embargo, el requisito clínico de la terapia EV aún no se puede cumplir con los métodos de aislamiento tradicionales debido al bajo rendimiento y costo. Este estudio informa de la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas a través de un enfoque de homogeneización de alta velocidad asistida por separación magnética. Aprovecha la vía de endocitosis de los MNP para aislar endosomas cargados de MNP mediante separación magnética, seguida de homogeneización de alta velocidad para formular endosomas en nanovesículas monodispersas. Dado que los tipos de endosomas recolectados por este protocolo son diversos, aún se requiere una investigación más profunda para establecer buenas prácticas de fabricación (GMP) en la industria. Este novedoso enfoque de preparación de EM es más eficiente en el tiempo (5 min de homogeneización a alta velocidad) para obtener nanovesículas homólogas a los EV nativos. Produce exponencialmente más vesículas a partir de la misma cantidad de células que la ultracentrifugación, que generalmente se puede aplicar a varios tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como sustituto de la terapia libre de células y de un sistema de administración de fármacos a nanoescala, los VE aún no han cumplido sus expectativas clínicas, y uno de los principales obstáculos es la falta de métodos de producción y purificación escalables y reproducibles6. Por lo tanto, se han desarrollado varios tipos de EM como análogos de EV con una complejidad biológica similar14. Hasta la fecha, el ejemplo de EM más utilizado son las nanovesículas deriv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el uso de instrumentos en la Instalación Central de Instrumentación Compartida en el Instituto de Medicina Básica y Cáncer (IBMC) de la Academia China de Ciencias. Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC; 82172598), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang, China (LZ22H310001), el Proyecto de Formación de Talentos de Salud 551 de la Comisión de Salud de la Provincia de Zhejiang, China, el Proyecto de Investigación de Desarrollo Agrícola y Social de la Oficina Municipal de Ciencia y Tecnología de Hangzhou (2022ZDSJ0474) y la Beca de Investigación Interdisciplinaria Qiantang.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
Referências
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