En magnetisk separationsassisterad höghastighetshomogeniseringsmetod för storskalig produktion av endosom-härledda vesiklar
Summary
Här beskriver vi en magnetisk separationsassisterad höghastighetshomogeniseringsmetod för storskalig produktion av endosom-härledda nanovesiklar som en ny typ av exosomhärmare (EM) som delar samma biologiska ursprung och liknande struktur, morfologi och proteinsammansättning av nativa extracellulära vesiklar (EV).
Abstract
Extracellulära vesiklar (EV) har väckt stor uppmärksamhet inom fysiologisk och patologisk forskning, sjukdomsdiagnos och behandling; Den kliniska översättningen har dock begränsats av bristen på metoder för uppskalning. Därför tillhandahåller detta protokoll en magnetisk separationsassisterad höghastighetshomogeniseringsmetod för storskalig produktion av endosomhärledda nanovesiklar som en ny typ av exosomhärmare (EM) härledda från endosomerna, som har cirka 100 gånger högre utbyte än konventionell ultracentrifugeringsmetod. I denna metod internaliserades magnetiska nanopartiklar (MNP) av föräldracellerna via endocytos och ackumulerades därefter i deras endosomer. Därefter samlades MNP-laddade endosomer in och renades genom hypoton behandling och magnetisk separation. En höghastighetshomogenisator användes för att bryta MNP-laddade endosomer till monodispersa nanovesiklar. De resulterande endosomhärledda vesiklarna har samma biologiska ursprung och struktur, kännetecknade av analys av spårning av nanopartiklar, transmissionselektronmikroskop och western blotting. Deras morfologi och proteinsammansättning liknar nativa EVs, vilket indikerar att EMs potentiellt kan fungera som ett billigt och högavkastande surrogat för nativa EVs för kliniska översättningar.
Introduction
Extracellulära vesiklar (EV) är små vesiklar som utsöndras av nästan alla celler med ett storleksintervall på 30-150 nm, som innehåller rikligt med bioaktiva ämnen. Beroende på ursprungscellen uppvisar EV hög heterogenitet och har flera komponenter som är specifika för föräldraceller1. EV släpps ut i kroppsvätskor och transporteras till avlägsna platser där de tas upp av målceller för åtgärd2, som kan användas för att leverera ett brett spektrum av bioaktiva molekyler och läkemedel för vävnadsreparation, tumördiagnos och behandling och immunmodulering 3,4. Andra biologiska nanopartiklar (t.ex. lipoproteiner) och nanovesiklar (t.ex. EV som härrör från icke-endosomala vägar) med liknande biofysiska egenskaper i kroppsvätskor påverkar dock oundvikligen EV-isolering och rening. Hittills är ultracentrifugering fortfarande guldstandarden för EV-isolering, och andra isoleringsmetoder, inklusive sackarosdensitetsgradientcentrifugering, ultrafiltrering, polyetylenglykolutfällning, kromatografi och immunmagnetisk pärlisolering, har utvecklats5. Den nuvarande flaskhalsen som begränsar klinisk översättning och kommersialisering av EV-terapier är den allvarliga bristen på isoleringstekniker som möjliggör mycket skalbar och reproducerbar isolering av EV 6,7,8. Traditionella EV-isoleringstekniker (t.ex. ultracentrifugering och storleksuteslutningskromatografi) lider av lågt utbyte (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 celler), lång produktionscykel (24-48 timmar), dålig reproducerbarhet av produktkvalitet och kräver dyr och energikrävande produktionsutrustning som inte kan möta den nuvarande kliniska efterfrågan på EV6.
Exosommimics (EM), syntetiska surrogat för inhemska elbilar, har väckt stor uppmärksamhet på grund av deras mycket likartade struktur, funktion och skalbarhet i produktionen. Den huvudsakliga källan till EM är från direkt extrudering av hela föräldraceller med kontinuerlig snittning9,10, vilket visar potenta biologiska funktioner som nativa EV11,12. Till exempel har EM som härrör från mänskliga mesenkymala stamceller från navelsträngen (hUCMSC) liknande sårläkningseffekter som nativa EV och är rikare på proteinsammansättning13. Även om EM som härrör från hela celler har den biologiska komplexiteten hos EV, är deras största nackdel produkternas heterogenitet eftersom de oundvikligen är förorenade av olika cellulära organeller och cellrester. Proteinlokaliseringsanalys avslöjade vidare att EM som härrör från helcellsextrudering innehåller många icke-EVs-specifika proteiner från mitokondrier och det endoplasmatiska nätverket13. Dessutom kräver de flesta metoder för tillverkning av elektrometriska elektrometriker fortfarande ultracentrifugering, en mycket tids- och energikrävande process14. Med tanke på det faktum att exosomer uteslutande härrör från cellulära endosomer, antog vi att biokonstruerade endosom-härledda nanovesiklar bättre kan rekapitulera den biologiska homologin mellan exosomer och EM i jämförelse med de väletablerade cellmembran-härledda EM som produceras med helcellsextruderingsmetod14. Ändå är det svårt att tillverka endosom-härledda nanovesiklar på grund av bristen på genomförbara metoder.
Kliniska studier har genomförts genom att använda EV som ett surrogat för cellfri terapi och ett läkemedelsleveranssystem i nanoskala för behandling av olika sjukdomar. Till exempel har EV som härrör från benmärgens mesenkymala stamceller använts för att behandla allvarlig lunginflammation orsakad av covid-19 och har uppnått lovande resultat. Nyligen har genetiskt modifierade elbilar som bär CD24-proteiner också visat potenta terapeutiska fördelar för behandling av COVID-19-patienter15,16. Det kliniska kravet på EV-behandling kan dock fortfarande inte uppfyllas med traditionella isoleringsmetoder på grund av det låga utbytet och kostnaden. Denna studie rapporterar den storskaliga produktionen av endosom-härledda nanovesiklar via en magnetisk separationsassisterad höghastighetshomogeniseringsmetod. Den drar nytta av MNP:s endocytosväg för att isolera MNP-laddade endosomer via magnetisk separation, följt av höghastighetshomogenisering för att formulera endosomer till monodispersa nanovesiklar. Eftersom de typer av endosomer som samlas in av detta protokoll är olika, krävs ytterligare djupgående forskning fortfarande för att etablera god tillverkningspraxis (GMP) i branschen. Denna nya EM-beredningsmetod är mer tidseffektiv (5 min höghastighetshomogenisering) för att erhålla nanovesiklar som är homologa med nativa EV. Det producerar exponentiellt fler vesiklar från samma mängder celler än ultracentrifugering, som i allmänhet kan tillämpas på olika celltyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som ett surrogat för cellfri terapi och ett system för läkemedelstillförsel i nanoskala har elbilar ännu inte uppfyllt sina kliniska förväntningar, och ett huvudhinder är bristen på skalbara och reproducerbara produktions- och reningsmetoder6. Därför har olika typer av EM utvecklats som EV-analoger med liknande biologisk komplexitet14. Hittills är det mest använda exemplet på EM nanovesiklar från cellplasmamembran. Framställningen av sådana nanovesiklar är…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner användningen av instrument vid Shared Instrumentation Core Facility vid Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences. Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen, Kina (LZ22H310001), 551 Health Talent Training Project of Health Commission of Zhejiang-provinsen, Kina, Agricultural and Social Development Research Project of Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau (2022ZDSJ0474) och Qiantang Interdisciplinary Research Grant.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
Referências
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
