Vi presenterar ett protokoll för ett glasbaserat, semihydroponiskt experimentellt system som stödjer tillväxten av en mängd fylogenetiskt distinkta växter med eller utan mikrober. Systemet är kompatibelt med olika odlingssubstrat och tillåter icke-destruktiv rotexsudatprovtagning för nedströmsanalys.
Rotexsudat formar gränsytan mellan växt och jord, är involverade i näringscykeln och modulerar interaktioner med markorganismer. Rotexsudat är dynamiska och formas av biologiska, miljömässiga och experimentella förhållanden. På grund av deras stora mångfald och låga koncentrationer är det svårt att fastställa exakta exsudatprofiler, särskilt i naturliga miljöer där andra organismer är närvarande, som omsätter växtbaserade föreningar och själva producerar ytterligare föreningar. Det semihydroponiska experimentsystemet för glasburkar som introduceras här möjliggör kontroll över biologiska, miljömässiga och experimentella faktorer. Det tillåter tillväxt av olika fylogenetiskt distinkta växtarter i upp till flera månader med eller utan mikrober, i en mängd olika odlingsmedier. Den glasbaserade designen erbjuder en låg metabolitbakgrund för hög känslighet och låg miljöpåverkan eftersom den kan återanvändas. Exsudat kan samplas icke-destruktivt, och förhållandena kan ändras under loppet av ett experiment om så önskas. Installationen är kompatibel med masspektrometrianalys och andra nedströms analytiska procedurer. Sammanfattningsvis presenterar vi ett mångsidigt tillväxtsystem som lämpar sig för känslig rotexsudatanalys under en mängd olika förhållanden.
I tätbefolkade jordar utgör rhizosfären en kolrik nisch. Den formas av växtrötter via utsöndring av upp till 20 % av assimilerat kol och hyser mikrobiella samhällen som skiljer sig från det inhemska jordmikrobiomet 1,2,3,4,5,6. I takt med att forskare utnyttjar de fördelaktiga funktionerna hos rotassocierade mikrober och den potential för hållbart jordbruk som följer med det7, har denna observation, ofta kallad rhizosfäreffekten, varit i fokus för växande vetenskapliga ansträngningar. Än så länge är dock den kemiska dialogen mellan mikroorganismer och växter, som föreslås vara drivkraften bakom rhizosfäreffekten, fortfarande dåligt förstådd och därför är den mekanistiska förståelsen för utvecklingen av tillförlitliga mikrobiella lösningar inom jordbruket begränsad 8,9,10.
Att dechiffrera rotexsudat i markmiljöer där metaboliter lätt absorberas av jordpartiklar och snabbt omsätts av mikrobiella samhällen är inte okomplicerat, särskilt inte för växtarter med fina rotsystem som modellväxten Arabidopsis thaliana11. Det är därför som rotexsudat i de flesta studier provtas från hydroponiska system. I dessa mikrokosmos hålls luftiga delar av växter på plats av skräddarsydda växthållare eller mer lågmälda material som nät, agar och glaspärlor. Behållarna som används sträcker sig från petriskålar över flerbrunnsplattor till olika anpassade och kommersiella lådor med eller utan luftningsfilter 12,13,14,15,16,17,18,19. Beroende på systemet kommer växternas tillväxtförhållanden att variera mycket och återspegla naturliga förhållanden i större eller mindre utsträckning.
Här presenterar vi ett glasbaserat, semihydroponiskt system som är experimentellt mottagligt och ger mycket reproducerbara resultat. Den är enkel att montera och använda och är baserad på allmänt tillgängliga material. Systemet är baserat på en glasburk fylld med glaspärlor, som drar nytta av glasvarornas återanvändbara karaktär och lågbindande egenskaper (figur 1). Pärlorna ger fysiskt stöd för den växande växten och simulerar mekanisk impedans, vilket bidrar till en mer jordliknande rotarkitektur jämfört med hydroponiska uppställningar 19,20,21. Om glaspärlorna inokuleras med mikrober utgör de ytor som bakterier kan fästa på.
Glasburken kan stängas för att bibehålla steriliteten och systemet är utformat för att ge tillräckligt med utrymme för huvudet och luftcirkulationen, vilket undviker en miljö mättad i fukt. Burkarna är lämpliga för långvarig tillväxt av olika växtarter och kan skalas upp och ner med hjälp av burkar i olika storlekar. Här visas tillämpningar för sex växtarter, som täcker C3- och C4-gräs, dikoter och baljväxter. Bland dem finns modellarterna A. thaliana (dicot), Brachypodium distachyon (C3 monocot), Medicago truncatula (baljväxter), samt grödor som Solanum lycopersicum (tomat, dicot), Triticum aestivum (vete, C3 monocot) och Sorghum bicolor (sorghum, C4 monocot). Protokollet som presenteras inkluderar experimentell uppställning av systemet, frösterilisering och groning av sex växtarter, transplantation av plantor till burkar, olika odlingsmedier, mikrobinokulering, rotexsudatprovtagning och exsudatbearbetning för analys.
Det experimentella systemet som presenteras här är baserat på glasburkar och glaspärlor och ger därmed ett enkelt, lättskött och mångsidigt semihydroponiskt system för att studera rotutsöndring i olika sammanhang. Det har använts i studier som undersökt utsöndringsprofilerna hos olika växtarter25, utsöndringens respons på olika tillväxtförhållanden25, samt inverkan av markens fysiokemiska egenskaper på utsöndring22. Systemet är lämpligt för alla växtarter som testas här under längre tillväxtperioder, från veckor till månader. Upprätthållandet av sterila förhållanden är enkelt, liksom inokuleringen med bakterier, som kvarstår under den analyserade 2-veckors tillväxtperioden. Således möjliggör det experimentella systemet inte bara en kontrollerad insamling av rotexsudat under sterila förhållanden, utan det kan också användas för att studera interaktioner mellan växter och mikrober. Dessutom kan växternas odlingsmedier varieras för att studera metaboliska svar på olika näringsnivåer, och tillväxtperioderna kan justeras genom att anpassa ljusförhållandena eller använda burkar av olika storlek.
Studier av rotexsudat under hydroponiska eller semihydroponiska förhållanden är fortfarande standard inom området, främst på grund av den förbättrade upplösningen av lågkoncentrerade metaboliter11. Många hydroponiska metoder förlitar sig på petriskålar, flerbrunnsplattor eller andra små behållare som möjliggör sterilitet och hög genomströmning men begränsar experimenten till små växter eller plantor som odlas i miljöer med hög luftfuktighet 17,18,26,27. I den presenterade glasburksuppsättningen tillhandahålls tillräckligt med huvudutrymme av de jämförbart stora burkarna, vilket möjliggör förlängda tillväxtperioder. Mikroportejpremsor säkerställer luftväxling samtidigt som steriliteten bibehålls. På så sätt kan även höga monocots som korn och majs odlas i glasburken i flera veckor. Små växter som A. thaliana och klöver kan studeras i 4-5 veckor efter groning, inklusive vegetativa och reproduktiva stadier.
Alternativa hydroponiska uppställningar finns också tillgängliga för större anläggningar, men dessa kräver ofta skräddarsydda lådor och inlopp gjorda av nät, skumskivor och ingreppskorgar för växtstöd 15,28,29,30. Dessutom är dessa enheter vanligtvis inte inställda för att vara sterila, eller så kräver de utmanande installations- och underhållsprocedurer för att hålla dem fria från mikrobiella och/eller kemiska föroreningar. Installation och underhåll av sterilitet i det presenterade experimentella systemet är okomplicerat. Dessutom minskar användningen av glas för burkar och pärlor förekomsten av föroreningar som läcker ut från plast och sparar resurser eftersom det enkelt kan tvättas och återanvändas.
Glaspärlor har tidigare använts för att efterlikna jordpartiklar. De inducerar naturlig rotutveckling i rotutsöndringsprovtagningsanordningar såsom exsudationsfällor31 eller andra semihydroponiska system19. Glasburken drar nytta av denna utveckling och introducerar pärlorna som en koloniseringsyta för mikrober. I jord utvecklas mikrobiomet runt växtrötter i en halvfast miljö, med kompakta partiklar och utrymmen fyllda med luft eller vatten. Även om glasburken inte inkluderar aktiv luftning av odlingsmediet, vilket gör att den nedre vätskefasen sannolikt inte innehåller optimala syrenivåer, skapar kombinationen av en större pärlvolym med en mindre volym av tillväxtmediet en fuktig men ändå luftig övre fas där mikrober kan växa under oxiska förhållanden. Andra har föreslagit att skaka tillväxtbehållare26,28 eller använda slangar kopplade till luftpumpar19,29 för att upprätthålla lufttillförseln i hydroponiska tillväxtsystem. Dessa system är dock antingen inställda på att inte vara sterila eller kräver specialmaterial och konstant övervakning för att upprätthålla steriliteten. Dessutom, vid skakning, var mycket försiktig för att undvika att skott dränks i tillväxtlösningar och skador på rotsystemen. Icke desto mindre, om så önskas, kan den experimentella uppställningen anpassas med ytterligare material för luftning.
En viktig aspekt att ta hänsyn till i alla studier av växt-mikrobinteraktion som undersöker metabolism är att mikrober bryter ner växtbaserade föreningar och producerar metaboliter på egen hand. Utan en specialiserad steril experimentuppställning är det inte möjligt att skilja mellan växt- och mikrobbaserade metaboliter. För att hämma mikrobiell aktivitet och berika växtbaserade föreningar föreslog Oburger et al. att kemiskt sterilisera rotexsudatprovtagningslösningen för att hämma bakteriell nedbrytning32. Effekten av kemiska inhibitorer kunde studeras i det presenterade experimentella systemet, där man jämförde exsudationsprofiler för sterila kontra icke-sterila växter som behandlats med eller utan inhibitor.
En huvudsaklig begränsning med den presenterade glasburksuppsättningen är att tillväxtförhållandena förblir mycket artificiella jämfört med jord. Exsudat från jordodlade växter samlas ofta antingen in från perkolationssystem13, där lösningsmedelsflöden samlas upp vid basen av tillväxtbehållare, eller jord-hydroponiska hybridsystem, där växter initialt odlas i jord och sedan överförs till hydroponiska förhållanden16,33. Till skillnad från glasburkar är dessa procedurer vanligtvis destruktiva och tillåter inte flera insamlingar över tid i föränderliga tillväxtmiljöer. I perkolerande system provtas dessutom jordbakgrunden tillsammans med exsudat, medan man i jord-hydroponiska hybridsystem kringgår problemet med hög metabolisk bakgrund i jorden genom att övergå till hydroponiska förhållanden för uppsamling av exsudat. Även om återhämtningstider har implementerats för att minska metabolitläckage via skadade rötter11, är växtöverföringen mycket störande och sår kommer sannolikt att kvarstå, och växtmetabolismen kan förändras som svar på överföring till hydroponiska förhållanden. Dessutom induceras i många fall en osmotisk chock genom att växter överförs till vatten i stället för en lämplig tillväxtlösning16,33. I det presenterade protokollet byts tillväxtlösningen ut mot en ekvimolär lösning för att upprätthålla osmotisk balans, vilket fortfarande gör det möjligt att fånga upp utsöndring inom ett kort, definierat tidsfönster. Byte av tillväxtlösning är vanlig praxis i många publicerade studier och kan enkelt uppnås i hydroponiska uppställningar utan rotskador 12,16,26,34. På grund av sin mångsidighet kan det experimentella systemet som presenteras enkelt anpassas för att efterlikna mer naturliga förhållanden, till exempel genom att använda sterilt eller icke-sterilt jordextrakt som en tillväxtlösning med eller utan närvaro av fasta jordpartiklar. Den gradvisa förändringen mot naturliga förhållanden gör det möjligt att studera effekterna av de olika fysiokemiska markegenskaperna och den mikrobiella närvaron på växternas metabolism och fysiologi. Innan forskarsamhället har en god förståelse för utsöndring i olika miljöer är det önskvärt att använda jordbaserade och hydroponiska system parallellt, eftersom båda uppställningarna har sina fördelar och begränsningar13.
Sammanfattningsvis sticker den presenterade semihydroponiska, glasbaserade experimentella uppställningen ut på grund av sin enkelhet i kombination med hög mångsidighet av applikationer. Det presenterar ett lättillgängligt, billigt sätt att samla in och studera utsöndring under sterila förhållanden, eller i kombination med mikrober och växt-mikrobinteraktioner.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Prof. Dr. Nicola Zamboni och Prof. Dr. Uwe Sauer från ETH Zürich, Schweiz, för bestämning av rotutsöndringsprofilerna med direktinjektion och Prof. Dr. Klaus Schläppi från universitetet i Basel för A. thaliana kommensala bakterier. Vidare erkänner vi Swiss National Science Foundation (PR00P3_185831 till J.S., som stöder S.M., A.S., E.M.S.) och PSC-Syngenta Fellowship-programmet (beviljat till Prof. Dr. Klaus Schläppi och J.S., som stöder C.J.).
Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
Aluminum foil | FORA GmbH | ||
Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |