Vi presenterer en protokoll for et glassbasert, semihydroponisk eksperimentelt system som støtter veksten av en rekke fylogenetisk distinkte planter med eller uten mikrober. Systemet er kompatibelt med forskjellige vekstmedier og tillater ikke-destruktiv rotekssudatprøvetaking for nedstrømsanalyse.
Rotekssudater former plante-jordgrensesnittet, er involvert i næringssyklus og modulerer interaksjoner med jordorganismer. Rotekssudater er dynamiske og formet av biologiske, miljømessige og eksperimentelle forhold. På grunn av deres brede mangfold og lave konsentrasjoner er nøyaktige ekssudatprofiler utfordrende å bestemme, enda mer i naturlige miljøer der andre organismer er til stede, snu planteavledede forbindelser og produsere ytterligere forbindelser selv. Det semihydroponiske glassburkeksperimentelle systemet introdusert her tillater kontroll over biologiske, miljømessige og eksperimentelle faktorer. Det tillater vekst av ulike fylogenetisk distinkte plantearter i opptil flere måneder med eller uten mikrober, i en rekke forskjellige vekstmedier. Den glassbaserte designen gir en lav metabolittbakgrunn for høy følsomhet og lav miljøpåvirkning, da den kan gjenbrukes. Ekssudater kan prøves ikke-destruktivt, og forholdene kan endres i løpet av et eksperiment hvis ønskelig. Oppsettet er kompatibelt med massespektrometrianalyse og andre nedstrøms analytiske prosedyrer. Oppsummert presenterer vi et allsidig vekstsystem egnet for sensitiv rotekssudatanalyse under en rekke forhold.
Innenfor tett befolket jord presenterer rhizosfæren en karbonrik nisje. Den er formet av planterøtter via ekssudasjon av opptil 20% av assimilert karbon og har mikrobielle samfunn som er forskjellige fra det bosatte jordmikrobiomet 1,2,3,4,5,6. Som forskere utnytter de fordelaktige funksjonene til rotassosierte mikrober og potensialet for bærekraftig landbruk som følger med det7, har denne observasjonen, ofte betegnet som rhizosfæreffekten, vært fokus for økende vitenskapelig innsats. Men så langt er den kjemiske dialogen mellom mikroorganismer og planter, som foreslås å være driveren av rhizosfæreeffekten, fortsatt dårlig forstått, og derfor er den mekanistiske forståelsen for utvikling av pålitelige mikrobielle løsninger i landbruket begrenset 8,9,10.
Dechiffrering av rotekssudater i jordmiljøer der metabolitter lett absorberes av jordpartikler og raskt snus av mikrobielle samfunn er ikke enkelt, spesielt for plantearter med fine rotsystemer som modellplanten Arabidopsis thaliana11. Dette er grunnen til at det i de fleste studier blir tatt prøver av rotekssudater fra hydroponiske systemer. I disse mikrokosmos holdes luftdeler av planter på plass av tilpassede planteholdere eller mer lavmælte materialer som nett, agar og glassperler. Beholderne som brukes spenner fra petriskåler over flerbrønnsplater til ulike tilpassede og kommersielle bokser med eller uten luftefilter 12,13,14,15,16,17,18,19. Avhengig av systemet vil plantevekstforholdene variere sterkt og gjenspeile naturlige forhold i større eller mindre grad.
Her presenterer vi et glassbasert, semihydroponisk system som er eksperimentelt mottagelig og gir svært reproduserbare resultater. Det er enkelt å montere og bruke og er basert på allment tilgjengelige materialer. Systemet er basert på en glasskrukke fylt med glassperler, og utnytter glassets gjenbrukbare natur og lavbindingsegenskaper (figur 1). Perlene gir fysisk støtte til den voksende planten og simulerer mekanisk impedans, noe som bidrar til mer jordlignende rotarkitektur sammenlignet med hydroponiske oppsett 19,20,21. Hvis de inokuleres med mikrober, presenterer glassperlene overflater for bakterier å feste seg til.
Glassburken kan lukkes for å opprettholde steriliteten, og systemet er utformet for å gi tilstrekkelig headspace og luftsirkulasjon, og unngå et miljø mettet av fuktighet. Krukkene er egnet for langvarig vekst av forskjellige plantearter og kan skaleres opp og ned ved hjelp av krukker i forskjellige størrelser. Her vises applikasjoner for seks plantearter, som dekker C3 og C4 gress, dicots og belgfrukter. Blant dem er modellartene A. thaliana (dicot), Brachypodium distachyon (C3 monocot), Medicago truncatula (belgfrukter), samt avlinger som Solanum lycopersicum (tomat, dicot), Triticum aestivum (hvete, C3 monocot) og Sorghum bicolor (sorghum, C4 monocot). Protokollen som presenteres inkluderer eksperimentelt oppsett av systemet, frøsterilisering og spiring av seks plantearter, transplantasjon av frøplanter til krukker, forskjellige vekstmedier, mikrobeinokulering, rotekssudatprøvetaking og ekssudatbehandling for analyse.
Det eksperimentelle systemet som presenteres her er basert på glasskrukker og glassperler og gir dermed et enkelt, lite vedlikehold og allsidig semihydroponisk system for å studere rotekssudasjon i ulike sammenhenger. Det har blitt brukt i studier som undersøker ekssudasjonsprofilene til forskjellige plantearter25, responsene på ekssudasjon til forskjellige vekstforhold25, samt påvirkning av jordens fysiokjemiske egenskaper på ekssudasjon22. Systemet er egnet for alle plantearter som testes her i lengre vekstperioder, fra uker til måneder. Vedlikehold av sterile forhold er enkelt, det samme er inokuleringen med bakterier, som vedvarer over den analyserte 2-ukers vekstperioden. Dermed tillater det eksperimentelle systemet ikke bare en kontrollert samling av rotekssudater i sterile forhold, men det kan også brukes til å studere plantemikrobe-interaksjoner. Videre kan plantevekstmediene varieres for å studere metabolske responser på forskjellige næringsnivåer, og vekstperioder kan justeres ved å tilpasse lysforholdene eller bruke krukker av ulik størrelse.
Studier av rotekssudater i hydroponiske eller semihydroponiske forhold forblir standard i feltet, hovedsakelig på grunn av den forbedrede oppløsningen av lavkonsentrasjonsmetabolitter11. Mange hydroponiske tilnærminger stole på petriskåler, flerbrønnsplater eller andre små beholdere som tillater sterilitet og høy gjennomstrømning, men begrenser eksperimentering til små planter eller frøplanter dyrket i miljøer med høy luftfuktighet 17,18,26,27. I det presenterte glassburkoppsettet er tilstrekkelig hodeplass gitt av de sammenlignbare store krukkene, noe som gir lengre vekstperioder. Mikropore tape striper sikrer luftutveksling samtidig som steriliteten opprettholdes. Dermed kan selv høye monocots som bygg og mais dyrkes i glassburkoppsettet i flere uker. Små planter som A. thaliana og kløver kan studeres i 4-5 uker etter spiring, inkludert vegetative og reproduktive stadier.
Alternative hydroponiske oppsett er også tilgjengelige for større planter, men disse krever ofte skreddersydde bokser og innløp laget av nett, skumplater og engraftmentkurver for plantestøtte 15,28,29,30. I tillegg er disse enhetene vanligvis ikke satt opp for å være sterile, eller de krever utfordrende oppsetts- og vedlikeholdsprosedyrer for å holde dem fri for mikrobielle og / eller kjemiske forurensninger. Oppsett og vedlikehold av sterilitet i det presenterte eksperimentelle systemet er grei. I tillegg reduserer bruken av glass til krukker og perler tilstedeværelsen av forurensninger som lekker ut fra plast og sparer ressurser da det lett kan vaskes og gjenbrukes.
Glassperler har blitt brukt tidligere for å etterligne jordpartikler. De induserer naturlig rotutvikling i rotekssudasjonsprøvetakingsenheter som ekssudasjonsfeller31 eller andre semihydroponiske systemer19. Glass-krukkeoppsettet utnytter denne utviklingen og introduserer perlene som en koloniseringsoverflate for mikrober. I jord utvikler mikrobiomet rundt planterøtter seg i et halvfast miljø, med kompakte partikler og mellomrom fylt med luft eller vann. Selv om glassburkoppsettet ikke inkluderer aktiv lufting av vekstmediet på grunn av hvilken den nedre væskefasen sannsynligvis ikke inneholder optimale oksygennivåer, skaper kombinasjonen av et større dråpevolum med et mindre vekstmediumvolum en fuktig, men luftet øvre fase hvor mikrober kan vokse under oksiske forhold. Andre har foreslått å riste vekstbeholdere26,28 eller bruke rør koblet til luftpumper19,29 for å opprettholde lufttilførselen i hydroponiske vekstsystemer. Imidlertid er disse systemene enten satt opp for ikke å være sterile, eller krever spesialisert materiale og konstant overvåking for å opprettholde sterilitet. I tillegg, når det gjelder risting, er det mye forsiktighet for å unngå nedsenking av skudd i vekstløsninger og skade på rotsystemer. Likevel, hvis ønskelig, kan det eksperimentelle oppsettet tilpasses med tilleggsmateriale for lufting.
Et avgjørende aspekt å vurdere i alle plantemikrobeinteraksjonsstudier som undersøker metabolisme, er at mikrober nedbryter planteavledede forbindelser og produserer metabolitter alene. Uten et spesialisert sterilt eksperimentelt oppsett er det ikke mulig å skille mellom plante- og mikrobeavledede metabolitter. For å hemme mikrobiell aktivitet og berike planteavledede forbindelser, foreslo Oburger et al. å kjemisk sterilisere rotekssudatprøveløsningen for å hemme bakteriell nedbrytning32. Effekten av kjemiske hemmere kunne studeres i det presenterte eksperimentelle systemet, og sammenligne ekssudasjonsprofiler av sterile versus ikke-sterile planter behandlet med eller uten inhibitoren.
En hovedbegrensning i det presenterte glassburkoppsettet er at vekstforholdene forblir svært kunstige sammenlignet med jord. Ekssudater fra jorddyrkede planter samles ofte enten fra perkolasjonssystemer13, hvor løsningsmiddelgjennomstrømninger samles ved foten av vekstbeholdere, eller jordhydroponiske hybridsystemer, hvor planter først dyrkes i jord og deretter overføres til hydroponiske forhold16,33. I motsetning til glassburkoppsettet er disse prosedyrene vanligvis destruktive, og tillater ikke flere samlinger over tid i skiftende vekstmiljøer. Videre, mens i perkolerende systemer, blir jordbakgrunnen samplet sammen med ekssudatene, i jordhydroponiske hybridsystemer blir problemet med høy jordmetabolsk bakgrunn omgått med overføringen til hydroponiske forhold for ekssudatoppsamling. Selv om gjenopprettingstider er implementert for å redusere metabolittlekkasje via sårede røtter11, er planteoverføringen svært forstyrrende og sår vil sannsynligvis vedvare, og plantemetabolisme kan endres som respons på overføring til hydroponiske forhold. Dessuten induseres et osmotisk sjokk i mange tilfeller ved å overføre planter til vann i stedet for en passende vekstløsning16,33. I den presenterte protokollen byttes vekstløsningen ut med en ekvimolær løsning for å opprettholde osmotisk balanse, som fortsatt tillater å fange ekssudasjon innen et kort, definert tidsvindu. Endringen av vekstløsning er vanlig praksis i mange publiserte studier og kan enkelt oppnås i hydroponiske oppsett uten rotsår 12,16,26,34. På grunn av sin allsidighet kan det eksperimentelle systemet som presenteres lett tilpasses for å etterligne mer naturlige forhold, for eksempel ved å bruke sterilt eller ikke-sterilt jordekstrakt som vekstløsning med eller uten tilstedeværelse av faste jordpartikler. Den gradvise endringen mot naturlige forhold gjør det mulig å studere virkningen av de forskjellige fysiokjemiske jordegenskapene og mikrobiell tilstedeværelse på plantemetabolisme og fysiologi. Før det vitenskapelige samfunnet har en god forståelse av ekssudasjon i ulike miljøer, er det ønskelig å bruke jordbaserte og hydroponiske systemer parallelt, da begge oppsettene har sine fordeler og begrensninger13.
Avslutningsvis skiller det presenterte semihydroponiske, glassbaserte eksperimentelle oppsettet seg ut på grunn av sin enkelhet kombinert med høy allsidighet av applikasjoner. Den presenterer en tilgjengelig, rimelig måte å samle inn og studere ekssudasjon i sterile forhold, eller i kombinasjon med mikrober og plantemikrobeinteraksjoner.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Prof. Dr. Nicola Zamboni og Prof. Dr. Uwe Sauer fra ETH Zürich, Sveits, for å bestemme rotekssudasjonsprofilene med direkte injeksjon og Prof. Dr. Klaus Schläppi fra Universitetet i Basel for A. thaliana commensal bakterier. Videre anerkjenner vi Swiss National Science Foundation (PR00P3_185831 til JS, som støtter S.M., A.S., E.M.S.) og PSC-Syngenta Fellowship-programmet (gitt til Prof. Dr. Klaus Schläppi og JS, som støtter CJ).
Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
Aluminum foil | FORA GmbH | ||
Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |