جهاز تجميع صوتي ثلاثي الأبعاد للتصنيع الشامل للكرويات الخلوية
Summary
تعتبر كرويات الخلايا نموذجا محتملا في مجال التطبيقات البيولوجية. توضح هذه المقالة بروتوكولات لتوليد كرويات الخلايا بشكل متطور باستخدام جهاز تجميع صوتي 3D ، والذي يوفر طريقة فعالة للتصنيع القوي والسريع للكرويات الخلوية الموحدة.
Abstract
كرويات الخلية واعدة ثلاثية الأبعاد (3D) النماذج التي اكتسبت تطبيقات واسعة في العديد من المجالات البيولوجية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لتصنيع كرويات الخلايا عالية الجودة وعالية الإنتاجية باستخدام جهاز تجميع صوتي 3D من خلال إجراءات قابلة للمناورة. يتكون جهاز التجميع الصوتي من ثلاثة محولات طاقة تيتانات الزركونات الرصاص (PZT) ، كل منها مرتب في المستوى X / Y / Z لغرفة بولي ميثيل ميثاكريلات مربعة (PMMA). يتيح هذا التكوين إنشاء نمط صفيف نقطي 3D للعقد الصوتية المرفوعة (LANs) عند تطبيق ثلاث إشارات. نتيجة لذلك ، يمكن دفع الخلايا الموجودة في محلول الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) إلى الشبكات المحلية ، لتشكيل مجاميع خلايا موحدة في ثلاثة أبعاد. ثم يتم معالجة محلول GelMA بالأشعة فوق البنفسجية وتشابكه ليكون بمثابة سقالة تدعم نمو مجاميع الخلايا. أخيرا ، يتم الحصول على كتل من الكرويات الناضجة واسترجاعها عن طريق إذابة سقالات GelMA لاحقا في ظل ظروف معتدلة. سيمكن جهاز تجميع الخلايا الصوتية 3D الجديد المقترح من تصنيع كرويات الخلايا ، وحتى المواد العضوية ، مما يوفر تقنية محتملة كبيرة في المجال البيولوجي.
Introduction
تم التعرف على نماذج الزراعة ثلاثية الأبعاد في المختبر ، والتي توفر المزيد من الخصائص الهيكلية والمورفولوجية الشبيهة بالجسم الحي مقارنة بنماذج الثقافة ثنائية الأبعاد التقليدية ، كأنظمة واعدة في مختلف التطبيقات الطبية الحيوية مثل هندسة الأنسجة ونمذجة الأمراض وفحص الأدوية1،2،3. كنوع واحد من نموذج الثقافة ثلاثية الأبعاد ، تشير كرويات الخلايا عادة إلى تجميع الخلايا ، مما يخلق هياكل كروية ثلاثية الأبعاد تتميز بتفاعلات خلية خلية ومصفوفة خليةمحسنة 4،5،6. لذلك ، أصبح تصنيع كرويات الخلايا أداة قوية لتمكين الدراسات البيولوجية المتنوعة.
تم تطوير تقنيات مختلفة ، بما في ذلك القطرة المعلقة7 ، أو الألواح غير اللاصقة8 ، أو أجهزة microwell9 ، للحصول على كرويات. من حيث المبدأ ، تسهل هذه الطرق عادة تجميع الخلايا من خلال استخدام القوى الفيزيائية مثل قوة الجاذبية مع تقليل التفاعلات بين الخلايا والركيزة. ومع ذلك ، فإنها غالبا ما تنطوي على عمليات كثيفة العمالة ، وذات إنتاجية منخفضة ، وتشكل تحديات للتحكم في حجم كروي10,11. الأهم من ذلك ، أن إنتاج كرويات بالحجم المطلوب والتوحيد بكمية كافية له أهمية قصوى لتلبية تطبيقات بيولوجية محددة. على عكس الطرق المذكورة أعلاه ، أظهرت الموجات الصوتية ، كنوع واحد من التقنيات التي تحركها القوة الخارجية12،13،14 ، إمكانية التصنيع الشامل للكرويات الخلوية بجودة عالية وإنتاجية عالية ، بناء على مبدأ تعزيز تجميع الخلايا من خلال القوى الخارجية15،16،17،18. على عكس القوى الكهرومغناطيسية أو المغناطيسية ، فإن تقنيات معالجة الخلايا القائمة على الصوت غير جراحية وخالية من الملصقات ، مما يتيح تكوين كروي مع توافق حيوي ممتاز19,20.
بشكل عام ، تم تطوير الموجات الصوتية السطحية الدائمة (SAWs) والأجهزة القائمة على الموجات الصوتية السائبة (BAWs) لتوليد كرويات ، باستخدام العقد الصوتية (ANs) التي تنتجها الحقول الصوتية الدائمةالمقابلة 21،22،23. على وجه الخصوص ، اكتسبت أجهزة التجميع الصوتية القائمة على BAWs ، مع مزايا التصنيع المريح والتشغيل السهل وقابلية التوسع الممتازة ، الانتباه لتصنيع كرويات الخلية24,25. لقد قمنا مؤخرا بتطوير جهاز تجميع صوتي سهل قائم على BAWs مع القدرة على توليد كرويات ذات إنتاجية عالية26. يتكون الجهاز المقترح من غرفة مربعة متعددة الميثيل ميثاكريلات (PMMA) مع ثلاثة محولات تيتانات الزركونات الرصاص (PZT) مرتبة على التوالي في المستوى X / Y / Z. يتيح هذا الترتيب إنشاء نمط صفيف نقطي 3D للعقد الصوتية المرفوعة (LANs) لتجميع خلايا القيادة. بالمقارنة مع الأجهزة المستندة إلى BAWs أو SAWs التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، والتي يمكنها فقط إنشاء مجموعة 1D أو 2D من ANs27،28،29 ، يتيح الجهاز الحالي مجموعة نقطية ثلاثية الأبعاد من شبكات LAN لتشكيل إجمالي الخلايا السريع داخل محلول الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA). بعد ذلك ، نضجت مجاميع الخلايا إلى كرويات ذات قابلية عالية للبقاء داخل سقالات GelMA المعالجة ضوئيا بعد ثلاثة أيام من الزراعة. أخيرا ، تم الحصول بسهولة على عدد كبير من الأجسام الكروية ذات الحجم الموحد من سقالات GelMA للتطبيقات النهائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن التصنيع الفعال والمستقر للكرويات الخلوية ذات الإنتاجية العالية باستخدام تقنيات مثل جهاز التجميع الصوتي ثلاثي الأبعاد يحمل وعدا كبيرا لتطوير الهندسة الطبية الحيوية وفحص الأدوية1،2،3. يبسط هذا النهج الإنتاج الضخم للكرويات الخلوية من خ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم عمل Tis من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1104600) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ في الصين (LQ23H160011).
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
Referências
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer’s disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
