Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

Qihong Zheng; Xiaoxiang Xiang; Yan Yan; Huapeng  H. Yu

doi:10.3791/66080

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Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

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DOI:

10.3791/66080

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19 de janeiro de 2024

Qihong Zheng^*¹ , Xiaoxiang Xiang^*¹ , Yan Yan²^,³ , Huapeng H. Yu¹

¹School of Life Sciences, SUSTech University, ²Shenzhen PKU-HKUST Medical Center, ³Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Resumo

A visualização de proteínas em células vivas usando GFP (Green Fluorescent Protein) e outras etiquetas fluorescentes melhorou muito a compreensão da localização, dinâmica e função de proteínas. Em comparação com a imunofluorescência, a imagem viva reflete com mais precisão a localização de proteínas sem potenciais artefatos decorrentes da fixação tecidual. É importante ressaltar que imagens ao vivo permitem a caracterização quantitativa e temporal dos níveis e localização de proteínas, cruciais para a compreensão de processos biológicos dinâmicos, como movimento ou divisão celular. No entanto, uma das principais limitações das abordagens de marcação fluorescente é a necessidade de níveis de expressão proteica suficientemente altos para alcançar uma visualização bem-sucedida. Consequentemente, muitas proteínas fluorescentes marcadas endogenamente com níveis de expressão relativamente baixos não podem ser detectadas. Por outro lado, a expressão ectópica usando promotores virais pode, por vezes, levar à má localização de proteínas ou alterações funcionais em contextos fisiológicos. Para abordar essas limitações, é apresentada uma abordagem que utiliza a detecção de proteínas mediadas por anticorpos altamente sensíveis em embriões vivos, essencialmente realizando imunofluorescência sem a necessidade de fixação tecidual. Como prova de princípio, o receptor Notch marcado com GFP endogenamente que é pouco detectável em embriões vivos pode ser visualizado com sucesso após a injeção de anticorpos. Além disso, essa abordagem foi adaptada para visualizar modificações pós-traducionais (MPTs) em embriões vivos, permitindo a detecção de mudanças temporais nos padrões de fosforilação da tirosina durante o início da embriogênese e revelando uma nova subpopulação de fosfotirosina (p-Tyr) sob membranas apicais. Essa abordagem pode ser modificada para acomodar outros anticorpos específicos para proteínas, específicos para tags ou específicos para PTM e deve ser compatível com outros organismos modelo ou linhagens celulares passíveis de injeção. Este protocolo abre novas possibilidades para imagens ao vivo de proteínas de baixa abundância ou PTMs que anteriormente eram difíceis de detectar usando métodos tradicionais de marcação fluorescente.

Introdução

A imunofluorescência é uma técnica fundamental da biologia celular moderna originalmente desenvolvida por Albert Coons, que permite a detecção de moléculas em seus compartimentos celulares nativos e a caracterização das composições moleculares de organelas ou máquinas^{subcelulares1}. Aliada às manipulações genéticas, a imunofluorescência ajuda a estabelecer o conceito hoje bem aceito de que a localização de proteínas é essencial para sua função². Além de anticorpos primários específicos e corantes fluorescentes brilhantes, o sucesso dessa técnica depende de um processo preliminar denominado fixação e permeabilização, que p....