फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी इंजेक्शन के माध्यम से रहने वाले ड्रोसोफिला भ्रूण में कम बहुतायत प्रोटीन और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की कल्पना
Summary
यह प्रोटोकॉल अनुकूलित एंटीबॉडी-आधारित प्रतिदीप्ति लेबलिंग और प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में इंजेक्शन का वर्णन करता है ताकि पारंपरिक जीएफपी / एमचेरी-टैग दृष्टिकोणों का उपयोग करके पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण कम-बहुतायत प्रोटीन या पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की लाइव इमेजिंग को सक्षम किया जा सके।
Abstract
जीएफपी (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) और अन्य फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के दृश्य ने प्रोटीन स्थानीयकरण, गतिशीलता और कार्य की समझ में काफी सुधार किया है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तुलना में, लाइव इमेजिंग अधिक सटीक रूप से ऊतक निर्धारण से उत्पन्न होने वाली संभावित कलाकृतियों के बिना प्रोटीन स्थानीयकरण को दर्शाता है। महत्वपूर्ण रूप से, लाइव इमेजिंग प्रोटीन के स्तर और स्थानीयकरण के मात्रात्मक और लौकिक लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है, जो गतिशील जैविक प्रक्रियाओं जैसे सेल आंदोलन या विभाजन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, फ्लोरोसेंट टैगिंग दृष्टिकोण की एक प्रमुख सीमा सफल दृश्य को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता है। नतीजतन, अपेक्षाकृत कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ कई अंतर्जात टैग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता नहीं लगाया जा सकता है। दूसरी ओर, वायरल प्रमोटरों का उपयोग करके एक्टोपिक अभिव्यक्ति कभी-कभी शारीरिक संदर्भों में प्रोटीन मिसलोकलाइजेशन या कार्यात्मक परिवर्तन का कारण बन सकती है। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया जाता है जो जीवित भ्रूण में अत्यधिक संवेदनशील एंटीबॉडी-मध्यस्थता प्रोटीन का पता लगाने का उपयोग करता है, अनिवार्य रूप से ऊतक निर्धारण की आवश्यकता के बिना इम्यूनोफ्लोरेसेंस का प्रदर्शन करता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, अंतर्जात जीएफपी-टैग किए गए नॉच रिसेप्टर जो जीवित भ्रूण में मुश्किल से पता लगाने योग्य है, एंटीबॉडी इंजेक्शन के बाद सफलतापूर्वक कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को जीवित भ्रूणों में पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जिससे प्रारंभिक भ्रूणजनन के दौरान टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन पैटर्न में अस्थायी परिवर्तनों का पता लगाने और एपिकल झिल्ली के नीचे फॉस्फोटाइरोसिन (पी-टायर) के एक उपन्यास उप-जनसंख्या का खुलासा हुआ। इस दृष्टिकोण को अन्य प्रोटीन-विशिष्ट, टैग-विशिष्ट, या पीटीएम-विशिष्ट एंटीबॉडी को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और अन्य इंजेक्शन-उत्तरदायी मॉडल जीवों या सेल लाइनों के साथ संगत होना चाहिए। यह प्रोटोकॉल कम बहुतायत प्रोटीन या पीटीएम की लाइव इमेजिंग के लिए नई संभावनाएं खोलता है जो पहले पारंपरिक फ्लोरोसेंट टैगिंग विधियों का उपयोग करके पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण थे।
Introduction
इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधुनिक कोशिका जीव विज्ञान की आधारशिला तकनीक है जो मूल रूप से अल्बर्ट कॉन्स द्वारा विकसित की गई है, जो उनके मूल सेलुलर डिब्बों में अणुओं का पता लगाने और उपकोशिकीय ऑर्गेनेल या मशीनरी की आणविक रचनाओं के लक्षण वर्णन को सक्षम बनातीहै। आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ युग्मित, immunofluorescence अब अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते हैं अवधारणा है कि प्रोटीन स्थानीयकरण अपने समारोह2 के लिए आवश्यक है स्थापित करने में मदद करता है. विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और उज्ज्वल फ्लोरोसेंट रंगों के अलावा, इस तकनीक की सफलता निर्धारण और पारगम्यता नामक एक प्रारंभिक प्रक्रिया पर निर्भर करती है, जो सेलुलर आकृति विज्ञान को संरक्षित करती है, एंटीजन को स्थिर करती है, और इंट्रासेल्युलर डिब्बों में एंटीबॉडी की पहुंच को बढ़ाती है। अनिवार्य रूप से, निर्धारण और पारगम्यता प्रक्रिया कोशिकाओं को मार देगी और सभी जैविक प्रक्रियाओं को समाप्त कर देगी3. इसलिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस केवल प्रोटीन की जीवन यात्रा का स्नैपशॉट प्रदान करता है। हालांकि, सेल माइग्रेशन और डिवीजनों जैसे कई जैविक प्रक्रियाएं प्रकृति में गतिशील हैं, एक स्थानिक-अस्थायी रूप से हल किए गए तरीके से प्रोटीन व्यवहार की जांच की आवश्यकता होती है 4,5.
जीवित जीवों में प्रोटीन की गतिशीलता की जांच करने के लिए, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी)6 और उच्च गति वाले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर आधारित लाइव इमेजिंग विधियों का विकास किया गया है। संक्षेप में, ब्याज की प्रोटीन आनुवंशिक रूप से GFP7 के साथ जुड़े होने के लिए हेरफेर किया जा सकता है, और फिर सनकी रूप से वायरल या खमीर प्रमोटरों जैसे साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी)8 या अपस्ट्रीम सक्रियण अनुक्रम (यूएएस)9से व्यक्त किया जा सकता है। क्योंकि जीएफपी प्रकृति में ऑटोफ्लोरोसेंट है, लक्ष्य प्रोटीन के स्थानीयकरण को प्रकट करने के लिए कोई फ्लोरोफोर-युग्मित एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं होती है, जो निर्धारण या पारगम्यता की प्रारंभिक प्रक्रियाओं की आवश्यकता को दरकिनार करता है। पिछले दो दशकों में, तरंग दैर्ध्य के पूरे स्पेक्ट्रम में फैले फ्लोरोसेंट टैग10 विकसित किए गए हैं, जो एक ही समय में कई लक्ष्य प्रोटीन के बहु-रंग लाइव इमेजिंग को सक्षम करते हैं। हालांकि, ऐसे AlexaFluor या ATTO के रूप में रासायनिक इंजीनियर फ्लोरोसेंट रंगों की तुलना में, इन आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन के autofluorescence अपेक्षाकृत कमजोर और अस्थिर है जब अंतर्जात प्रमोटरों से व्यक्त की, विशेष रूप से लंबे समय तक तराजू10 से अधिक लाइव इमेजिंग के दौरान. हालांकि इस कमी को फ्लोरोसेंटली टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन को अधिक व्यक्त करके कम किया जा सकता है, कई एंजाइमेटिक गतिविधियों जैसे कि किनेसेस और फॉस्फेटेस के साथ शारीरिक स्तर पर व्यक्त नहीं किए जाने पर सामान्य जैविक प्रक्रियाओं को गंभीर रूप से बाधित करते हैं।
यह प्रोटोकॉल एक ऐसी विधि प्रस्तुत करता है जो एक लाइव छवि सेटअप में फोटोटेबल एंटीबॉडी-आधारित लक्ष्य रोशनी को सक्षम बनाता है, अनिवार्य रूप से निर्धारण या पारगम्यता(चित्रा 1)की प्रक्रिया के बिना इम्यूनोफ्लोरेसेंस की अनुमति देता है। एक साधारण एनएचएस आधारित प्राथमिक अमाइन प्रतिक्रिया11 के माध्यम से, एक अनिवार्य रूप से किसी भी प्राथमिक एंटीबॉडी या GFP/HA/Myc नैनो12 के साथ AlexaFluor 488 या 594 जैसे फ्लोरोसेंट रंगों को संयुग्मित कर सकता है। एक विकासात्मक विशेषता का लाभ उठाते हुए कि सभी ड्रोसोफिला भ्रूण कोशिकाएं सिंकिटियम चरण13 के दौरान एक सामान्य साइटोप्लाज्म साझा करती हैं, कोई डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी के इंजेक्शन के बाद पूरे भ्रूण में एंटीजन बाइंडिंग और रोशनी प्राप्त कर सकता है। ड्रोसोफिला और अन्य मॉडल सिस्टम14 में उपलब्ध अंतर्जात टैग प्रोटीन के पुस्तकालयों के विस्तार के साथ, इस विधि संभावित रूप से कम बहुतायत फ्लोरोसेंटली टैग प्रोटीन और अन्य गैर fluorescently टैग (एचए / Myc-टैग ) प्रोटीन जीवित ऊतकों में की गतिशीलता का खुलासा करके इन पुस्तकालयों के अनुप्रयोगों को व्यापक बना सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रस्तुत प्रक्रिया कस्टम एंटीबॉडी के साथ प्रतिदीप्ति लेबलिंग की विशेष विधि और प्रारंभिक चरण ड्रोसोफिला भ्रूण में बाद में इंजेक्शन की रूपरेखा तैयार करती है। यह तकनीक प्रोटीन या पोस्ट-ट्रांसले…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एसक्यूएच-जीएफपी ड्रोसोफिला लाइन प्रदान करने और इस तकनीक के प्रारंभिक विकास के लिए समर्थन प्रदान करने के लिए डॉ जेनिफर ए ज़ालेन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और नॉच-जीएफपी ड्रोसोफिला लाइन प्रदान करने के लिए डॉ फ्रेंकोइस श्वेइसगुथ। इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (32270809) से एचएचयू, स्कूल ऑफ लाइफ साइंसेज, एसयूएसटेक से उदार वित्तीय और कर्मचारियों के समर्थन और शेन्ज़ेन साइंस एंड टेक्नोलॉजी इनोवेशन कमीशन / JCYJ20200109140201722 से वाई यान को वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Referências
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