Aqui, descrevemos uma ferramenta avançada projetada para o monitoramento da biossíntese de clorofila durante os estágios iniciais da desetiolação de plântulas de Arabidopsis . A nova metodologia fornece imagens não invasivas de fluorescência da clorofila em tempo real com alta resolução espacial e temporal.
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Artigo de método
Ensaio Não Invasivo para Determinação da Cinética de Biossíntese de Clorofila durante os Estágios Iniciais da Desetiolação de Arabidopsis
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A biossíntese de clorofila é uma marca da desetiolação, uma das fases mais dramáticas do ciclo de vida das plantas. O processo rigidamente controlado e altamente dinâmico de biossíntese de clorofila é desencadeado durante a mudança do escuro para a luz em plantas com flores. No momento em que as plântulas etioladas são expostas aos primeiros vestígios de luz solar, a rápida conversão (em ordem de segundos) de protoclorofilida em clorofilida é mediada por complexos proteicos únicos que aceitam a luz, levando através de etapas metabólicas subsequentes à produção de clorofila totalmente funcional. As técnicas padrão para análise do teor de clorofila incluem a extração de pigmentos de tecidos vegetais destacados, o que não se aplica ao estudo de processos tão rápidos. Para investigar a cinética da clorofila in vivo com alta acurácia e resolução espaço-temporal nas primeiras horas após a desetiolação induzida pela luz, um instrumento e um protocolo foram desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento detalhado desenhado para quantificação estatisticamente robusta de clorofila nos estágios iniciais da desetiolação de Arabidopsis .
Introdução
A desetiolação representa a fase mais dramática do ciclo de vida das plantas, caracterizada por uma série de alterações morfológicas e rearranjo completo do metabolismo vegetal (de hetero para autotrópico)1. A biossíntese de clorofila é uma característica da desetiolação induzida pela luz em plantas e um processo muito dinâmico. A formação de clorofila a partir de protoclorofilida precursora produzida no escuro deve ser fortemente coordenada para evitar danos causados por subprodutos reativos2. A redução do protoclorofilide a clorofilida é catalisada por protoclorofilídeos oxidorredutases (PORs) dependentes de luz, enzimas únicas ativadas diretamente pela luz. A reação é muito rápida, ocorrendo da ordem de ms as 3, levando ao acúmulo reconhecível de clorofila em poucos minutos após a irradiação das plântulas etioladas 4,5,6. É necessário mais tempo (de horas a dias) para que a biogênese dos cloroplastos estabeleça um aparelho fotossintético totalmente funcional3.
Existem vários métodos para analisar o teor de clorofila, incluindo cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou espectrofotometria. Usualmente, essas técnicas exigem a destruiçãodo tecido vegetal4,5,6, restringindo a determinação de alterações nos níveis de clorofila ao longo do tempo. Métodos que permitam o estabelecimento de cinética não invasiva da clorofila podem abrir uma nova perspectiva para o estudo de plantas em diversos aspectos, desde questões fundamentais de pesquisa, como a análise do processo de síntese de clorofila no tempo e no espaço, até aplicações mais práticas, como a avaliação da tolerância ao estresse ou do efeito de bioestimulantes sobre a cinética da clorofila. Diante disso, foi introduzido um sistema de monitoramento da formação de clorofila, o iReenCAM7. Ele incorpora uma câmera CCD, filtros de emissão, fontes de luz e uma tubulação para análise automatizada de fluorescência (Figura 1). A principal característica do dispositivo desenvolvido é a alta resolução espacial e temporal, desempenho superior nos parâmetros utilizados nas abordagens atuais, sensibilidade e especificidade suficientes quando comparado aos métodos analíticospadrão7.
O procedimento não-invasivo aqui descrito requer reagentes mínimos e compreende etapas simples, permitindo obter um perfil cinético de clorofila em mudas vivas de Arabidopsis durante estágios muito iniciais de desetiolização. O protocolo pode ser útil para o estudo de processos altamente dinâmicos de síntese de clorofila influenciados pelo número de fatores, tanto exógenos (sal, seca, bioestimulantes, metais pesados, etc.) quanto endógenos (tipicamente associados a alterações na atividade gênica) na origem, sem a necessidade de desprendimento de qualquer tecido vegetal, evitando assim estresse adicional.
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Protocolo
1. Preparação do meio
- Preparar o meio de cultivo misturando 0,75 g de gelificante com 50 mL de água deionizada estéril em um frasco de vidro para atingir uma concentração de 1,5% (p/v) para uma placa de Petri (120 x 120 x 17 mm). Agite suavemente a mistura e, em seguida, aqueça-a no micro-ondas até ferver para dissolver o agente gelificante (a solução torna-se clara).
- Deixe o meio arrefecer até 58-60 °C antes de prosseguir para os passos seguintes. Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em condições estéreis dentro de uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação.
- Use placas de Petri com bordas à prova de luz para evitar reflexão excessiva de luz actínica e alta autofluorescência de fundo durante as medições. Para isso, aplique fita adesiva preta (ou outros meios disponíveis) para cobrir todos os lados da placa de Petri vazia (Figura 2).
- Realizar a esterilização da(s) placa(s) após a aplicação da fita por irradiação com lâmpada germicida UV por 20-30 min.
- Se o experimento envolver tratamento químico (ou seja, estressores abióticos/bióticos, hormônios vegetais e/ou reguladores de crescimento, etc.), adicione a quantidade apropriada de produto químico correspondente diretamente ao meio. Esteja ciente de uma estabilidade química escolhida que está sendo adicionada ao meio (por exemplo, se o produto químico não for termoestável, adicione ao meio quando ele for resfriado antes de despejá-lo na placa). Misture bem o meio agitando para garantir uma distribuição uniforme do produto químico.
- Evite a iluminação das placas para a luz UV depois que a mídia é derramada (levaria à produção de radicais de oxigênio que poderiam interferir no experimento).
- Despeje o meio preparado na(s) placa(s) de Petri quadrada e deixe o meio solidificar à temperatura ambiente.
2. Esterilização da superfície das sementes e condições de crescimento das plantas
- Obter a quantidade necessária de sementes de Arabidopsis thaliana Col-0 da calha (10-20 mg) e adicioná-la a um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
NOTA: Nenhuma modificação específica é necessária ao trabalhar com diferentes linhas de Arabidopsis (linhas de ecótipo/mutantes). A revisão da grade de serragem e as etapas de medição devem ser realizadas para outras espécies vegetais, levando-se em consideração a diferença no tamanho das sementes, na taxa de germinação e no tamanho das plântulas. - Esterilizar superficialmente as sementes de Arabidopsis adicionando etanol a 70% ao tubo por 2 min. Agite suavemente os tubos durante a esterilização.
- Remova o etanol pipetando cuidadosamente, tomando cuidado para não perder nenhuma semente. Lave as sementes adicionando água estéril ao tubo por 5 min para remover qualquer etanol residual (agite suavemente os tubos durante o período de lavagem).
- Deixe as sementes sedimentarem para o fundo do tubo por gravidade, retire a água restante.
- Enxaguar novamente as sementes 2x com água estéril, conforme descrito na etapa 2.3, para garantir que estejam livres de quaisquer características de etanol. Deixe as sementes sedimentarem para o fundo do tubo por gravidade, retire a água restante.
- Adicione um volume igual de água estéril ao tubo que contém as sementes para criar uma suspensão de água de sementes.
- Utilizar uma grade de semeadura para distribuir uniformemente a suspensão de água de semente do genótipo dado nas áreas selecionadas da placa média (Figura 2 e Figura Suplementar 1). Distribuir as sementes (aproximadamente 30-40) em fileiras em cada área utilizando uma ponta de pipeta larga.
- Deixe a água secar nas áreas de sementes por cerca de 30 min, mantendo a(s) placa(s) aberta(s) em uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação. Sele a placa com fita adesiva de micropore e envolva-a com papel alumínio.
- Estratificar as sementes por 3 dias a 4 °C no escuro para, dependendo do ecótipo utilizado, superar a dormência e/ou promover uma germinação uniforme.
- Transferir a placa com sementes estratificadas para luz branca (150 μmol/m2/s) por 1 h para induzir a germinação (desembrulhar a folha apenas para o tratamento leve).
- Após o tratamento com luz, envolver a placa com papel alumínio para proteger as sementes da luz e colocá-la na posição vertical em uma câmara de crescimento e cultivar por 4 dias no escuro a 21 °C.
3. Medição e análise da fluorescência da clorofila
- Ligue o sistema iReenCAM e certifique-se de que o sistema está pronto e configurado corretamente no software do servidor PS iniciado automaticamente (por exemplo, se houver espaço de armazenamento suficiente para os dados do experimento, se a câmera de fluorescência estiver conectada ao PC, etc.).
- Ative o software Scheduler para criar o plano experimental para a medição clicando em Experimentos > Novo Experimento. Forneça um nome descritivo para o experimento e preencha os detalhes (descrição).
- Defina as ações necessárias para o experimento clicando em Adicionar ação , o que levará ao cronograma de ações experimentais.
NOTA: A palavra ação aqui significa realizar um experimento completo (ou seja, incluir todas as etapas necessárias para realizar uma medição de placa). - Especifique as condições para uma única medição redonda (ou seja, o comprimento do período de luz/escuridão).
- Ao clicar em Gerar Lista , defina os intervalos de tempo entre as rodadas de medição. Escolha o horário em que a rodada começará e terminará (4 h no total) e os intervalos entre as rodadas (na configuração atual, uma rodada a cada 2 min).
- Clique em Gerar e verifique se o período de tempo e os intervalos entre os impulsos de luz estão corretos, verificando a lista gerada no lado esquerdo da tela.
- Escolha o protocolo de medição (Figura 2 Suplementar). Salve todas as modificações no banco de dados para referência futura.
- Pouco antes do início da medição, use luz verde de baixa intensidade (ver Tabela de Materiais) dentro da sala escura e ajuste o nível da prateleira dentro da câmara de medição ou execute outras etapas de preparação antes de remover a folha da placa de Petri. Em seguida, desligue a luz e transfira as placas para a câmara de medição na escuridão completa.
- Retire cuidadosamente a folha de alumínio que cobre a placa de Petri que contém as mudas de 4 dias de idade. Coloque a placa de Petri horizontalmente dentro da câmara de medição do dispositivo. Dentro da câmara, induzir pulsos de luz actínica, e realizar imagens de acordo com o plano de experimento (ações) definido nas etapas 3.1-3.7.
OBS: É fundamental evitar qualquer iluminação das placas com mudas antes de colocá-las na câmara de medição. A manipulação com a placa com as plântulas etioladas deve ser realizada na sala/câmara escura (para um possível arranjo experimental ver Figura 3 Suplementar).
4. Extração e análise dos dados
- Depois de concluir a medição, abra o experimento correspondente no software do analisador.
- Para analisar a fluorescência das mudas, gere dois tipos de máscaras - uma máscara áspera (bandeja) que cobre a área onde as mudas estão localizadas, e uma máscara precisa (planta) que cobre apenas o tecido de interesse (tipicamente cotilédones).
- Gere uma máscara de bandeja clicando na opção Criar novo tipo de bandeja . Atribua os nomes de genótipos apropriados às respectivas áreas na imagem da placa.
- Para atribuir genótipo, escolha um número de imagem em Round e clique em Load Image na parte superior da tela. A imagem da placa será mostrada na tela. Ao clicar em qualquer um dos conjuntos de botões que representam diferentes ferramentas de desenho de formas (Figura Suplementar 4), entre no Novo Modo de Forma que permite desenhar a área de interesse na imagem da placa. Escolha as áreas necessárias (por exemplo, diferentes genótipos na placa) e forneça sua nomenclatura apropriada.
- Clique em Esc para sair do modo de forma. Salve a máscara de bandeja gerada (depois de fornecer um nome para ela) clicando em Armazenar Tipo de Bandeja.
- Volte uma etapa e aplique a máscara que foi gerada nas etapas anteriores selecionando seu nome na opção Alterar por tipo de bandeja .
- Para gerar máscara de planta com alta precisão, utilize a imagem adquirida após 180 min de medição (round 91) para definir o valor mínimo de intensidade do sinal de fluorescência, possibilitando a subtração do ruído de fundo. Para isso, remova o tick do Auto Threshold e defina um Limite Manual em 0 (Figura 4 Suplementar).
- Clique em Visualizar para garantir que a máscara da bandeja cubra todas as áreas necessárias (genótipos) na imagem da placa. Para isso, escolha a rodada 91 e clique em Atualizar visualização.
- Entre no menu Executar clicando em Executar. Execute a análise exclusivamente para a rodada 91, colocando um tick apenas na rodada 91. Em seguida, escolha o caminho de saída e clique em Iniciar análise.
- Após a conclusão da análise, o menu Concluir será aberto automaticamente. Escolha a rodada executada (será a única) dos experimentos e clique em Alternar Analisador para Dados Analisados para exportar os dados para este ponto de tempo específico (rodada 91).
- Extraia o arquivo .xsel do arquivo exportado, pois esse arquivo contém as informações essenciais da máscara de planta clicando no ícone Abrir Parte de Exportação .
- Reabra o experimento clicando no ícone Abrir Parte de Análise Local . Entre no menu do Construtor de Máscaras novamente, clique em Carregar Imagem, escolha a rodada 1 e, em seguida, Carregar do Arquivo no canto superior direito da tela e carregue o arquivo .xsel extraído anteriormente. A imagem da placa será mostrada com a máscara da bandeja aplicada.
- Salve a máscara clicando em Armazenar Tipo de Bandeja e aplique-a selecionando seu nome na opção Alterar por Tipo de Bandeja .
- Gere a máscara de planta ajustando o limiar de intensidade do sinal de fluorescência. Aumente o valor de Limiar Manual até que a máscara gerada no menu Visualizar se ajuste perfeitamente à ROI (por exemplo, cotilédones) em cada um dos genótipos (Figura Suplementar 4). Verifique se a máscara se encaixa em todas as rodadas das medidas rolando ao longo das rodadas (verificar o posicionamento adequado da máscara nas rodadas 1, 61 e 121 deve ser suficiente) no menu Visualização .
- Realizar a análise para todas as rodadas de medição e exportar dados.
NOTA: O arquivo de saída inclui valores de fluorescência de clorofila de um determinado genótipo para cada ponto de tempo, permitindo a construção de gráficos de escolha e facilitando a avaliação estatística adicional.
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Resultados
O resultado típico obtido usando o procedimento recém-desenvolvido em mudas de Arabidopsis desetioladas de 4 dias de idade do tipo selvagem (WT), ecótipo Columbia-0 (Col-0) é mostrado na Figura 3. Sob condições de controle (meio MS suplementado com DMSO), a curva biossintética da clorofila inicia-se com uma explosão inicial da síntese de clorofila, na qual o pool de protoclorfilídeos sintetizado durante a fase escotomorfogênica do crescimento é rapidamente convertido em clorofila de...
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Discussão
Etapas críticas do protocolo e solução de problemas - sem luz e cuide da máscara
Como destacado diretamente na descrição do protocolo acima, evitar até mesmo as quantidades residuais de luz, tanto durante o cultivo de mudas de plantas etioladas ou pouco antes de iniciar o protocolo, é de fundamental importância11. Em nossa configuração, usamos uma câmara escura dedicada localizada no phytotron walk-in e separada do resto do phytotron com porta giratória à prova de luz (...
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Divulgações
Z.B. e K.P. são funcionários da PSI e Martin Trtilek é CEO e proprietário da empresa PSI que produz o iReenCAM. Todos esses autores estiveram envolvidos no desenvolvimento do instrumento conforme descritoanteriormente7.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional – Projeto SINGING PLANT (nº. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Este projeto recebeu financiamento através do projeto MSCA4Ukraine (ID 1233580), que é financiado pela União Europeia. Somos gratos a Lenka Sochurkova pelo design gráfico da Figura 1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 6-benzilaminopurina | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Folha de alumínio | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 sementes | NASC coleção | N1092 | |
| Câmara de cultivo | PSI | feito sob medida | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf monocanal, variável (100-1000 μ L) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM dispositivo | PSI | feito sob medida/protótipo | |
| Frascos de laboratório, com tampas (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Caixa de fluxo laminar | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Fita de emenda de borracha sem revestimento, 19 mm de largura, preto, Ciência escocesa | 3M. Aplicado à vida | 7000006085 | |
| tubo de microcentrífuga, 2 mL com tampa, PPT, MARCA | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore fita | 3M Science. Aplicado à Vida | 7100225115 | |
| Osram lumilux verde l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| placas de Petri - Pratos Greiner, quadrados, 120 x 120 x17mm, ventilados | Pontas de pipeta Merck | Z617679-240EA | |
| , 1000 μ L, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| O software Plant Screen Data Analyzer | PSI | fornecido como parte do iReenCAM |
Referências
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Reimpressões e permissões
