Feldsammlung und Laborwartung von Kronendachbildendem Riesentang zur Erleichterung der Wiederherstellung

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Feldsammlung und die regelmäßige Laborpflege von Substraten, die mit kronenbildendem Riesentang besät sind, um sie in Wiederherstellungsversuchen zu verwenden, um den Erfolg und die Grenzen der “Grünkies“-Technik im Feld zu untersuchen.

Abstract

Kronenbildende Seetange sind wichtige Grundarten, die die biologische Vielfalt unterstützen und Ökosystemdienstleistungen im Wert von mehr als 500 Milliarden US-Dollar pro Jahr erbringen. Der weltweite Rückgang von Riesentangwäldern aufgrund klimabedingter ökologischer Stressoren unterstreicht die Notwendigkeit innovativer Wiederherstellungsstrategien. Eine aufkommende Renaturierungstechnik, die als “grüner Kies” bekannt ist, zielt darauf ab, junge Seetange großflächig ohne umfangreiche Unterwasserarbeit zu säen, und stellt aufgrund ihrer Kosteneffizienz und Skalierbarkeit ein vielversprechendes Wiederherstellungswerkzeug dar. Dieser Videoartikel veranschaulicht ein Protokoll und Werkzeuge zur Kultivierung von Riesentang, Macrocystis pyrifera. Es bietet auch eine Ressource für weitere Studien, um die Erfolge und Grenzen dieser Methode im Feld zu untersuchen. Wir skizzieren Feld- und Labormethoden zum Sammeln von Fortpflanzungsgewebe, Sporulieren, Impfen, Aufziehen, Pflegen und Überwachen von Substraten, die mit frühen Lebensstadien besät wurden, unter Verwendung der “Grünkies“-Technik. Das Protokoll vereinfacht und zentralisiert die aktuellen Wiederherstellungspraktiken in diesem Bereich, um Forscher, Manager und Interessengruppen bei der Erreichung der Ziele zum Schutz von Seetang zu unterstützen.

Introduction

Kronenbildende Seetange (braune Makroalgen in der Ordnung Laminariales) sind weltweit wichtige Grundarten, die küstennahe Felsenriffe in gemäßigten und arktischen Meeren dominieren¹. Diese Seetange bilden strukturell komplexe und hochproduktive biogene Lebensräume, die als Seetangwälder bekannt sind und taxonomisch vielfältige Meeresgemeinschaften unterstützen². Seetangwälder weltweit erbringen viele Ökosystemdienstleistungen für den Menschen, darunter die kommerzielle Fischereiproduktion, den Kohlenstoff- und Nährstoffkreislauf sowie Erholungsmöglichkeiten mit einem geschätzten Gesamtwert von 500 Milliarden US-Dollar pro Jahr³.

Trotz ihres erheblichen Wertes sind Seetangwälder in vielen Regionen einem wachsenden anthropogenen Druck ausgesetzt³. Der Klimawandel stellt aufgrund der langfristigen Erwärmung der Ozeane in Verbindung mit der zunehmenden Häufigkeit von Temperaturanomalien eine der größten Bedrohungen für Seetang^dar 3,4,5,6,7. Erhöhte Meerestemperaturen sind mit Nährstoffbeschränkungen verbunden⁸, während die Exposition gegenüber Hitzestress über physiologischen Schwellenwerten zur Sterblichkeit führen kann⁹. In Kombination mit variablen regionalen lokalen Stressoren⁷ gehen die Seetangpopulationen weltweit um etwa 2 % pro Jahr^{zurück 10} mit erheblichen Verlusten und anhaltenden Verschiebungen in alternative Gemeinschaftsstaaten in bestimmten Regionen 6,11,12,13,14. Die natürliche Erholung der Seetangpopulationen allein reicht möglicherweise nicht aus, um das Ausmaß der aktuellen und prognostizierten Verluste umzukehren 15,16,17,18, was die Bedeutung einer aktiven Wiederherstellung unterstreicht.

Aktuelle Bemühungen zur Wiederherstellung von Seetang können eine Kombination von Methoden verwenden, um diese wichtigen Grundarten an küstennahen Felsriffen wieder anzusiedeln ^3,19. Die gewählten Methoden zur Bewältigung standortspezifischer Probleme hängen vom geografischen Kontext, den spezifischen Hindernissen für die Kelp-Erholung und dem sozial-ökologischen Kontext^{ab 11}. Das Verständnis der Verbindungen und der Interdependenz sozial-ökologischer Systeme ist der Schlüssel, und Interventionen, die lokale Institutionen einbeziehen und die Unterstützung lokaler Gemeinschaften gewinnen, erhöhen die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Wiederherstellungsbemühungen²⁰.

Zusätzlich zum Klimawandel treibt, verringert oder unterdrückt der Druck von Pflanzenfressern oder interspezifischer Wettbewerb die Erholung (z. B. durch Seeigel¹³, pflanzenfressende Fische ^21,22, Rasenalgen ^9,23 oder invasive Algen²⁴). Die Wiederherstellung kann sich auf die Entfernung dieser biotischen Stressoren konzentrieren²⁵, obwohl diese Methoden erhebliche Ressourcen und kontinuierliche Wartung erfordern¹¹. Um die Erholung der Seetangarten zu katalysieren, gab es Bemühungen um einen direkten Aussaatansatz, z. B. das Wiegen von Netzbeuteln, die mit fruchtbaren Seetangblättern gefüllt sind, in das Benthos, das Zoosporen in die Umwelt freisetzt²⁶. Diese Methode ist jedoch zeitintensiv und erfordert einen technischen Ein- und Ausbau unter Wasser. Andere Fälle konzentrieren sich auf die Transplantation großer Mengen ganzer erwachsener Spenderpflanzen, die eng verwandte und gefährdete Spenderpopulationen gefährden können und aufgrund der Abhängigkeit von kontinuierlichen Transplantationen oft auf kleine Maßstäbe beschränkt sind²⁷.

Für Regionen, in denen die Begrenzung der Seetangsporen die Erholung des Seetangwaldes aufgrund der Fragmentierung des Lebensraums behindern kann, wurde ein relativ neuer Ansatz zur Wiederherstellung des Seetangs eingeführt, der als “grüner Kies” bezeichnet wird. Die Technik wurde erfolgreich an der Forschungsstation Flødevigen in Südnorwegen²⁸ getestet und stellte aufgrund ihrer Kosteneffizienz und Skalierbarkeit eine vielversprechende Option für die Wiederherstellung dar. Der Arbeitsablauf dieser Technik ist wie folgt: (1) Eine Sporenlösung wird aus fruchtbarem Gewebe hergestellt, das von reproduktiven erwachsenen Seetangen auf dem Feld gesammelt und dann auf kleine Substrate wie Kies gesät wird; (2) Kelps im Frühstadium werden unter laborkontrollierten abiotischen Bedingungen auf Substraten aufgezogen; (3) Substrate mit sichtbaren Sporophyten werden im Feld an bestimmten Riffen als “grüner Kies” eingesetzt, wo Sporophyten weiter wachsen. Beachten Sie, dass typische Transplantationsbemühungen erwachsener Individuen eine mühsame und kostenhemmende Unterwasserinstallation durch Taucher erfordern und die Technik des “grünen Kieses” eine einfache Entfaltung von der Oberfläche aus verwendet²⁸.

Die Technik des “grünen Kieses” wird derzeit von Mitgliedern zahlreicher internationaler Arbeitsgruppen²⁹ in verschiedenen Umgebungen und mehreren laminarischen Seetangarten erprobt. Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Einrichtungen, Materialien und Methoden für die Gewebeentnahme, Sporulation, Aussaat, Aufzuchtbedingungen, regelmäßige Wartung und Überwachung von Seetang im Frühstadium vor dem Einsatz dieser Wiederherstellungstechnik im Feld mit dem Riesentang Macrocystis pyrifera. Dieses Protokoll ist eine wertvolle Ressource für Forscher, Manager und Interessengruppen, die einen Einblick in die Erfolge und Grenzen dieser Methode mit M. pyrifera in verschiedenen Feldumgebungen geben möchten.

Protocol

Das in diesem Protokoll beschriebene Seetanggewebe wurde vom California Department of Fish and Wildlife im Rahmen der Genehmigung S-202020004-20205-001 gesammelt und überwacht. 1. Vorbereitung von Einrichtungen und Materialien Stellen Sie sicher, dass Kelp-Zuchtanlagen die Temperatur (10-15 °C) halten, Vollspektrumlicht (0-180 μmol Photonen m-2 s-1) und die Belüftung filtern können (0,2 μm Porengröße). Verwenden Sie Inkubatorsysteme mit eingebautem Auslass oder einem Zugangsanschluss für Drähte und Schläuche, Lampen und eine Luftquelle (Abbildung 1). Wenn ein Inkubatorsystem nicht innerhalb des Projektumfangs, des Budgets oder des beabsichtigten Umfangs liegt, verwenden Sie Wasserbäder, die durch kühles, natürliches Meerwasser oder einen Kühler temperiert werden (Abbildung 2). Spezifische Details finden Sie in der Materialtabelle .Legen Sie ein Thermometer in das Wachstumsmedium oder verwenden Sie eine Temperaturpistole, um sicherzustellen, dass die Temperatur zwischen 10 und 18 °C liegt.HINWEIS: Die Aufzuchttemperaturen sind standort- und jahreszeitenspezifisch30. Programmieren Sie Vollspektrumlichter auf eine Photoperiode von 12 h Licht: 12 h dunkel, indem Sie die Timing-Einstellungen an der Lichtquelle ändern oder einen mechanischen Timer verwenden. Messen Sie die Lichtintensität mit einem wasserdichten Quantenmessgerät für photosynthetisch aktive Strahlung (PAR) unter der Oberfläche in der Nähe des Kieses und stellen Sie sie mit einer dimmbaren Lichtquelle oder durch Schichten von Zellophan (bei vegetativer Gametophytenkultivierung siehe Abschnitt 9) oder einem Netz über der Lichtquelle (Einzelheiten zur Einstellung der Lichtintensität siehe Abschnitt 6.3) ein. Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Belüftung durch den Einsatz von Luftpumpen31 einen Tag nach der Sporulation. Verwenden Sie Filter (0,2 μm Porengröße), um die bakterielle Kontamination in der Luft zu reduzieren.HINWEIS: Bei der Kultivierung von “grünem Kies” muss der Belüftungsdruck ausreichen, um das Wasser in allen Kulturbehältern zirkulieren zu lassen, ohne die Anhaftung von Seetang im Frühstadium an ausgesäten Substraten zu stören. Sind Gametophytenbiomasse vorhanden (siehe Abschnitt 9.2), muss der Belüftungsdruck ausreichen, um Gametophyten in den Nährmedien suspendiert zu halten. Sterilisieren Sie Materialien und Stationen. Bereiten Sie diese im Voraus vor (siehe Materialtabelle).Reinigen Sie Oberflächen mit 70% Isopropylalkohol. Behandeln Sie reproduktives Sori-Gewebe und reinigen Sie die Sammelgeräte nach Möglichkeit außerhalb der ” Grünkies”-Gärtnerei. Verwenden Sie die folgenden Sterilisationsmethoden: Spülen Sie mit einem Reinigungsmittel in Laborqualität, gefolgt von einem gründlichen Spülen mit destilliertem Wasser, weichen Sie es in einer verdünnten Bleichlösung (gemäß den Anweisungen des Herstellers) ein, gefolgt von einem gründlichen Spülen mit destilliertem Wasser und autoklavieren Sie es mit geeigneten Einstellungen (Glaswaren oder Instrumente). Nach der Sterilisation können die Materialien in einem verschlossenen Behälter aufbewahrt oder mit Folie umwickelt werden. Schrubben und reinigen Sie die Behälter mit den Deckeln, die für die Kultivierung verwendet werden sollen, mit einem Reinigungsmittel in Laborqualität, gefolgt von einer gründlichen Spülung mit destilliertem Wasser.HINWEIS: Kulturbehälter mit Deckel tragen dazu bei, die Verdunstung von Wachstumsmedien zu reduzieren. Lassen Sie die Deckel leicht geöffnet, um den Luftaustausch zu ermöglichen, oder verwenden Sie ein Rückschlagventil, um die Kontamination in der Luft zu reduzieren. Wenn keine Behälter mit Deckel verfügbar sind, verschließen Sie Kulturbehälter mit einem Thermoplast wie Paraffinfolie und machen Sie 2-3 Perforationen. Wenn größere Tanks verwendet werden, verwenden Sie Anti-Verdunstungsabdeckungen aus transparentem Kunststoff. Stellen Sie sicher, dass Kies eine strukturierte oder leicht löchrige Oberfläche hat, da Gametophyten eher auf Substraten mit hoher Rauheit zurückgehalten werden32,33. Schrubben und spülen Sie Kies, bis das Wasser klar ist, um Staub oder Schmutz zu entfernen. Kies mindestens 24 h in einer 10%igen verdünnten Bleichlösung einweichen und mit filtersterilisiertem Meerwasser abspülen (siehe Abschnitt 2.1). Alternativ können Sie den Kies nach dem Schrubben und Spülen 1 Woche lang in deionisiertem (DI) Wasser einweichen32.HINWEIS: Idealerweise wird lokal geerntetes Substrat verwendet, um die Kontamination der Wiederherstellungsstelle zu reduzieren. Alternativ wird Kies in Aquarienqualität empfohlen. Vermeiden Sie kalkhaltige Substrate wie Kalkstein, die zum Ausbleichen des Gewebes und zur anschließenden Absterblichkeit von transplantiertem Seetang führen können32. 2. Vorbereitung von Wachstumsmedien Filtern und sterilisieren Sie Meerwasser nach den folgenden Methoden, abhängig von der Ressourcenverfügbarkeit. Berechnen Sie die Menge an filtersterilisiertem Meerwasser, die jede Woche zur Auffrischung von Kulturbehältern benötigt wird (siehe Abschnitt 7), und planen Sie diese Filtrations-/Sterilisationsaufgabe entsprechend. Lagern Sie große Mengen filtersterilisiertes Meerwasser in dunklen Behältern bis zu 6 Monate bei 8-10 °C. Wenn keine Kühlung verfügbar ist, lagern Sie es an einem dunklen, kühlen Ort.Filtern Sie Wasser mit einem Vakuumfiltrationssystem mit einer Porengröße von 0,55-1 μm. Schalten Sie die Vakuumquelle aus, bevor das gesamte Wasser durchgezogen ist, um eine Beschädigung des Filters zu vermeiden, und gießen Sie das gefilterte Wasser in einen speziellen sterilen Behälter. Verwenden Sie für größere Volumina ein Durchflussfiltersystem. Lassen Sie beispielsweise Meerwasser durch eine Reihe von drei Faltenfiltern (10 μm, 5 μm und 1 μm) laufen, die von der größten bis zur kleinsten Porengröße angeordnet sind.HINWEIS: Wenn natürliches Meerwasser nicht zugänglich ist, kann künstliches Meerwasser aufbereitet werden. Alternativ kann natürliches Meerwasser in großen Mengen in Aquariengeschäften gekauft werden und ist oft gefiltert, desinfiziert und pH-ausgeglichen. Für diese Optionen ist nach wie vor eine Medienanreicherung erforderlich. Sterilisieren Sie gefiltertes Meerwasser mit UV- und/oder Autoklaviermethoden. Schließen Sie Durchflusssysteme mit einer vom Hersteller empfohlenen Durchflussrate an ein Aquarium an. Autoklavieren Sie Meerwasser in autoklaviersicheren Glaswaren mit leicht geöffneten Deckeln oder mit Folie abgedeckt und in einem Flüssigkeitszyklus (121 °C; 1-2 PSI, 15-30 min je nach Flüssigkeitsvolumen34.HINWEIS: Das Autoklavieren von gefiltertem Meerwasser wird für die frühen Stadien der Kultur empfohlen. Die Anreicherung von filtersterilisiertem Meerwasser mit Nährstoffen und Vitaminen ist entscheidend für das Wachstum von M. pyrifera . Provasoli Enriched Seawater Media (PES) ist ein weit verbreitetes Medium für Algenkulturen35. Kaufen Sie dieses Medium in Algenkulturzentren. Zubereitungen von PES und zusätzlichen Vitaminen für das Wachstum von M. pyrifera sind in34 beschrieben.Reichern Sie alle 1 l gefiltertes Meerwasser mit 20 ml PES an. Alternativ können Sie Kulturmedien auf industriellem Niveau verwenden. Lagern Sie Anreicherungslösungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Anreicherung von filtersterilisiertem Meerwasser, wenn Wachstumsmedien benötigt werden, um eine Verschlechterung der Anreicherungslösungen zu vermeiden. 3. Feldsammlung Bestimmen Sie den Zeitpunkt der Sporophyllsammlungen, um den natürlichen Fortpflanzungszyklus lokaler M. pyrifera-Populationen nachzuahmen. Konsultieren Sie lokale Experten (z. B. Seetangforscher, Manager, Ökologen, Bürgerwissenschaftler, Tauchgruppen), um einen angemessenen Zeitpunkt für die Sporophyllsammlung sicherzustellen. Holen Sie die erforderlichen Genehmigungen für die Entnahme von Seetanggewebe ein, die den örtlichen Gesetzen und Vorschriften entsprechen. Dies kann ein zeitaufwändiger Teil des Kultivierungsprozesses sein und muss in den Projektzeitplan integriert werden. Durch ein umluftunabhängiges Unterwasseratemgerät (SCUBA) werden 3-5 Sporophyllblätter von 10-15 fruchtbaren M. pyrifera-Individuen mit sichtbaren Sori im Abstand von mindestens 2 m ausgewählt. Wählen Sie nach Möglichkeit saubere und intakte Sporophylle mit wenig bis gar keiner Verschmutzung oder Verschlechterung. Lagern Sie Sporophyllklingen ab diesem Zeitpunkt getrennt nach dem Elternindividuum.HINWEIS: Sporophylle wachsen in einer dichten “Schürze” an der Basis, über dem Halt des erwachsenen Seetangs, und können durch das Fehlen gasgefüllter Pneumatozysten identifiziert werden1. Reifes Sorusgewebe ist oft leicht erhaben und dunkler gefärbt als das umgebende Gewebe1. Transportieren Sie Sporophyllklingen in dunklen Auffangbeuteln, um eine übermäßige Sonneneinstrahlung zu vermeiden, mit minimalem Meerwasser vom Standort, um die Klingen feucht zu halten, und lagern Sie sie in Kühlboxen bei ca. 12 °C bis zur Ankunft im Anbauraum. Stellen Sie sicher, dass die Proben nicht in direktem Kontakt mit Eis stehen.HINWEIS: Sporophylle können an oder von anderen Orten versandt werden.Sporophylle mit Meerwasser abspülen. Wickeln Sie die Klingen, die von einem einzelnen M. pyrifera-Individuum gesammelt wurden, in feuchte Papiertücher, die in Meerwasser getränkt sind, und erneut in Aluminiumfolie, um das Eindringen von Licht und zusätzliche Austrocknung zu vermeiden36. Diese Art der Lagerung ist allgemein als “Burrito-Methode” bekannt. Legen Sie diese Verpackungen in eine Kühlbox mit Eis, mit einer Schutzbarriere wie recycelter Luftpolsterfolie oder Pappe. Bereiten Sie die Kühlbox für den Versand über Nacht vor. Stellen Sie sicher, dass jemand verfügbar ist, um die Sendung entgegenzunehmen, und stellen Sie die Pakete gekühlt auf. 4. Sporulation Verarbeiten Sie Sporophylle nach Möglichkeit in einer temperaturkontrollierten Umgebung zwischen 10-15 °C und fern von anderen Kulturen. Bereiten Sie Instrumente und Stationen im Voraus vor und sterilisieren Sie sie. Tragen Sie beim Umgang mit Seetanggewebe Schutzhandschuhe, um eine Kontamination zu reduzieren. Lagern Sie die Sporophylle optional 12-48 h in gekühlten Bedingungen, um die Sporenfreisetzung aus Sorusgewebe zu fördern37. Verwenden Sie zur Lagerung die in Abschnitt 3.3 beschriebene “Burrito-Methode”. Wählen Sie reifes Sorusgewebe aus und schneiden Sie es mit einer sterilen Schere in 25 cm2 Abschnitte. Wählen Sie 1-2 saubere Sori-Abschnitte von 10-15 einzelnen Kelp-Eltern, um die genetische Vielfalt zu fördern.Anmerkungen: Bei Lagerung finden Sie optional Anzeichen einer teilweisen Sporulation auf den Papiertüchern, die auf das Vorhandensein von fruchtbarem Sorusgewebe hinweisen. Sorusgewebe ist oft leicht erhaben und dunkler gefärbt als das umgebende Gewebe. Schrubben Sie zum Reinigen beide Seiten des Sorusgewebes vorsichtig nur in eine Richtung mit einer sterilen Gaze, die mit filtersterilisiertem Meerwasser angefeuchtet ist. Kratzen Sie das Sorusgewebe bei Bedarf vorsichtig mit einer sterilen Rasierklinge ab, um Verschmutzungen vollständig zu entfernen. Tauchen Sie den Sori-Abschnitt für 30 s bis 1 min in ein Süßwasserbad und spülen Sie ihn mit filtersterilisiertem Meerwasser ab.Anmerkungen: Frischen Sie das Süßwasserbad auf und sterilisieren Sie die verwendeten Materialien, wenn Sie verschiedene Sori-Abschnitte von verschiedenen Personen handhaben, um Kreuzkontaminationen zu reduzieren. Tauchen Sie jeden Sori-Abschnitt in filtersterilisiertes, auf 10-15 °C temperiertes Meerwasser in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Röhrchen bei 4-12 °C im Dunkeln platzieren, um maximal 4 h zu sporulieren. Wenn ein Kühlschrank nicht verfügbar ist, lagern Sie ihn an einem kühlen, lichtschwachen Ort.HINWEIS: Alternativ können Sori-Abschnitte in einem einzigen, sterilen Behälter sporuliert werden. Beobachten Sie mit einem Verbundmikroskop und einem Hämozytometer die Sporendichte von 3-4 Proben alle 30 Minuten bis zu 4 Stunden. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Proben. Wenn die Dichte mindestens 10.000 Sporen ml-1 beträgt (siehe Abschnitt 5.1.1), fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn ein Sori-Schnitt nach 4 Stunden keine Sporen produziert, ist die Probe zu verwerfen. Sporen können sich innerhalb von Stunden nach der Freisetzung absetzen, können aber auch beim Schwimmen in kreisenden Bewegungen beobachtet werden. Entfernen Sie jeden Sori-Abschnitt mit einer sterilen Pinzette aus den Röhrchen. Kombinieren Sie die resultierenden Sporenlösungen in einem einzigen, sterilisierten Behälter und quantifizieren Sie die endgültige kombinierte Dichte. 5. Impfung Berechnen Sie das endgültige Volumen der Sporenlösung, die für die Impfung benötigt wird. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration etwa 500-1.000 Sporen ml-1 in Kulturbehältern beträgt.Um die Konzentration der kombinierten Sporenprobe aus den Zählungen des Mittelgitters des Hämozytometers zu berechnen, teilen Sie die Anzahl durch 10-4 ml (entspricht dem im Hämozytometer angezeigten Lösungsvolumen). Um das Volumen der Sporenlösung zu bestimmen, die jedem Behälter hinzugefügt werden soll, bestimmen Sie die Menge an Wachstumsmedien, die zum Eintauchen von Substraten in Kulturbehälter benötigt wird. Um die Gesamtzahl der Sporen in jedem Behälter zu ermitteln, multiplizieren Sie dieses Meerwasservolumen mit der gewünschten Konzentration. Um das Gesamtvolumen der hinzuzufügenden Sporenlösung zu bestimmen, dividieren Sie die Gesamtmenge der Sporen durch die Konzentration der Sporen pro ml in der Sporenlösung. Legen Sie sterile Glasobjektträger in Kulturbehälter, um die Seetangentwicklung zu überwachen. Fügen Sie mindestens 30 Objektträger hinzu, die nach dem Zufallsprinzip auf Kulturbehälter verteilt sind, um eine ausreichende Überwachung zu gewährleisten (siehe Details in Abschnitt 7). Das berechnete Volumen der Sporenlösung wird mit einer sterilen Pipettenspitze, die in Wachstumsmedien getauchte Substrate enthält, in den Kulturbehälter inokuliert. Schließen Sie den Behälter und rühren Sie vorsichtig um, um die Sporen zu verteilen. Verschließen Sie den Behälter und stellen Sie ihn in das Kultursystem. 6. Aufzuchtbedingungen Stellen Sie die Temperatur zwischen 10 und 15 °C basierend auf der Temperatur am Einsatzort ein. Nach 1 Tag mit einer gefilterten Luftquelle für eine leichte Belüftung sorgen. Stellen Sie Vollspektrum-LED-Leuchten für Wasserpflanzen auf einen 12-Stunden-Licht: 12-Stunden-Dunkelzyklus ein, mit Lichtintensitäten zwischen 0-180 μmol Photon m-2 s-1:Stellen Sie die Lichtintensität von 0-1 Tag auf 5-10 μmol Photon m-2 s-1 ein und erhöhen Sie sie bis zum Ende von 1 Woche auf 20 – 30 μmol Photon m-2 s-1 . Von diesem Zeitpunkt an erhöhen Sie die Bestrahlungsstärke alle 3-4 Tage um 10-20 μmol Photon m-2 s-1 , bis am Ende von 6 Wochen eine Bestrahlungsstärke von 180 μmol Photon m-2 s-1 erreicht ist. Setzen Sie die Rear-Kulturen bei 180 μmol Photon m-2 s-1 bis zum Ende von 8 Wochen fort, oder wenn die Sporophyten eine Länge von etwa 1-2 cm erreicht haben. 7. Überwachung Überwachen Sie in den ersten zwei Wochen mindestens zwei zufällige Objektträger täglich/jeden zweiten Tag, um die Entwicklung zu beurteilen.Fassen Sie den Objektträger zur Überwachung mit einer sterilisierten Pinzette an und legen Sie ihn in eine saubere Petrischale, die genügend sterilisiertes Meerwasser enthält, um den Objektträger einzutauchen. Geben Sie Glasobjektträger nach dem Entfernen nicht in Kulturen zurück, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie ein zusammengesetztes oder inverses Mikroskop mit 40-400-facher Vergrößerung, um Seetang im Frühstadium zu beobachten. Verfolgen Sie die Entwicklung anhand der folgenden Zeitleiste (siehe Abbildung 3 für Beispiele für Entwicklungsstadien der Lebensgeschichte).HINWEIS: Abgesetzte Sporen werden bei 0-1 d beobachtet. Sporen können innerhalb weniger Stunden keimen, wie die Bildung eines Keimschlauchs zeigt. Die Keimung wird typischerweise bei 1-2 Tagen beobachtet. Frühe Gametophyten werden typischerweise bei 1-4 Tagen beobachtet. Gametogenese, der Prozess, bei dem sich Zellen teilen und differenzieren, um männliche und weibliche Gameten zu bilden, wird typischerweise innerhalb der ersten zwei Wochen beobachtet. Weibliche Zellen sind 5-7 mal größer als männliche. Männliche Gametophyten wachsen dünne, fadenförmige Äste, während Weibchen eher rund oder eiförmig geformt sind. Weibchen produzieren in der Regel innerhalb von 2-3 Wochen Eier oder Eizellen. Die von den Männchen freigesetzten Spermien schwimmen zu den Weibchen und befruchten die Eier, was zur Bildung von diploiden Zygoten führt. Die richtige Impfdichte gewährleistet eine erfolgreiche Fortpflanzung durch Nähe38,39. Befruchtete Eier entwickeln sich zu embryonalen Sporophyten. Sporophyten werden typischerweise innerhalb von 2-4 Wochen beobachtet. Die Zygote durchläuft eine schnelle Zellteilung, was innerhalb von etwa 6-8 Wochen zum Wachstum von 1-2 cm großen Klingen führt. Überwachen Sie nach zwei Wochen mindestens zwei zufällige Objektträger 1-2 Mal wöchentlich auf gesundes Wachstum und Kontamination, bis die Sporophyten eine Größe von 1-2 cm erreichen.HINWEIS: Gesundes Wachstum zeichnet sich durch eine goldbraune (im Gegensatz zu grüner oder transparenter) Färbung aus. Es gibt mehrere quantitative Metriken, die auf Objektträgern mit einem inversen Mikroskop beobachtet werden können, darunter Überlebensrate, Keimrate, vegetative Entwicklung, Fortpflanzungsreife und Fruchtbarkeit sowie Geschlechterverhältnis40. Beurteilen Sie die Kontamination durch Bakterien, Pilze, Wimperntierchen und Kieselalgen mit einem Mikroskop. Isolierte Verunreinigungen entfernen. Bekämpfung früher Anzeichen einer Kontamination mit Kieselalgen durch Behandlung mit Germaniumdioxid (GeO 2) (siehe Abschnitt 8.3). 8. Wartung Lichtverhältnisse gemäß Abschnitt 6.3 einstellen. Wechseln Sie jede Woche das Wachstumsmedium, um die notwendigen Nährstoffe und Mineralien für das Wachstum von M. pyrifera wieder aufzufüllen.Kühlen Sie frische Wachstumsmedien auf die entsprechende Temperatur. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur während dieses Vorgangs 15 °C nicht überschreitet. Saugen Sie Medien aus den Kulturbehältern, um eine Störung der ausgesäten Substrate zu vermeiden. Lassen Sie das Medium abtropfen, bis der Behälter fast leer ist. Aktualisieren Sie die Medien sofort, um das Austrocknen zu minimieren. Kippen Sie diese beim Nachfüllen leicht so, dass das Medium an der Seite des Kulturbehälters herunterläuft, um die Substrate minimal zu stören. Ordnen Sie die Behälter- oder Wannenpositionen während des wöchentlichen Medienwechsels nach dem Zufallsprinzip an, um Unterschiede in der Lichteinstrahlung zu berücksichtigen.HINWEIS: In der Zusatzdatei 1 finden Sie einen Kalender zur Verfolgung der Aktivitäten und Erwartungen für Macrocystis-Kulturen. Es zeigt den Zeitpunkt der Anpassung von Licht und Belüftung sowie den wöchentlichen Medienwechsel an. Optional kann die Kontamination mit Kieselalgen durch eine Behandlung mit Germaniumdioxid (GeO2) kontrolliert werden. Fügen Sie 0,3-0,5 ml 250 mg/ml GeO2 zu jedem 1 l Meerwasser hinzu, das den ausgesäten Substraten hinzugefügt wird, um die weit verbreitete Kontamination mit Kieselalgen zu reduzieren.HINWEIS: GeO2 kann die Produktion von Algengameten hemmen. Wenden Sie eine Behandlung mit GeO2 im kurzen Zeitfenster nach der Keimung und vor Spitzen der Ei- und Spermienproduktion (1-7 Tage) und/oder nach der Eibefruchtung und Sporophytenbeobachtungen (>21 Tage) an, gefolgt von einem Medienwechsel 48 Stunden danach, um die Chemikalie zu entfernen. Diese Zeitpläne können je nach Kulturbedingungen variieren, daher ist die Überwachung der Entwicklung im Lebensstadium mit Mikroskopie der beste Weg, um den Zeitpunkt der GeO2-Anwendung zu beurteilen. Wenn die Kieselalgenkontamination in Kulturbehältern anhält und ein Überwachsen auf Seetang im Frühstadium beobachtet wird, sollten Sie die Substrate neu aussäen. 9. Vegetative Gametophyten-Kultivierung von Riesentang Vermehren Sie Gametophytenkulturen das ganze Jahr über unter vegetativen Bedingungen, um die Abhängigkeit von der saisonalen Sporophyllsammlung aus dem natürlichen Riff zu verringern.Gametophytenkulturen entsprechend der Ausgangspopulation in mit Wachstumsmedien gefüllten Kolben bei 4-12 °C bei rotem Licht und einer Intensität von 5-20 μmol Photon m-2 s-1 in einem Dunkelzyklus von 12 Licht: 12 lagern. Sorgen Sie für konstante Belüftung und wechseln Sie alle 2-6 Monate das Medium. Um die Biomasse von Gametophyten, die asexuell gewachsen sind, für die Aussaat von “grünem Kies” zu erhöhen, die Belüftung zu erhöhen, um Gametophyten zu suspendieren, die Häufigkeit des Medienwechsels auf wöchentlich zu erhöhen und Gametophyten alle zwei Wochen zu fragmentieren.Gametophytenbiomasse im Kulturkolben durch Schütteln oder Rühren suspendieren und die Seiten des Kulturkolbens mit einem sterilen Werkzeug abkratzen, um anhaftende Gametophyten zu entfernen, falls erforderlich. Gießen Sie die suspendierten Gametophyten in einen sterilen Mixer oder eine Kaffeemühle und pulsieren Sie die Gametophytenlösung je nach Biomassekonzentration etwa 5-15 Mal 1-2 s lang, bis keine verklumpten Massen mehr sichtbar sind. Um die Fortpflanzung für die Aussaat von “grünem Kies” zu induzieren, fragmentieren Sie Gametophyten, wie oben erläutert. Dann das Substrat inokulieren und das Vollspektrum-LED-Licht von 5-20 auf 45-60 μmol Photon m-2 s-1 (+10 μmol Photon m-2 s-1 täglich zur Photoakklimatisierung) erhöhen, dann alle 3-4 Tage um 10-20 μmol Photon m-2 s-1 erhöhen, bis eine Bestrahlungsstärke von 180 μmol Photon m-2 s-1 erreicht ist. 10. Bereitstellung Stellen Sie nach 6-8 Wochen Laborkultivierung sicher, dass die jungen Sporophyten 1-2 cm lang und bereit für den Einsatz sind (Abbildung 4). Aktualisieren Sie Wachstumsmedien in Kulturbehältern 24 Stunden vor der Bereitstellung. Holen Sie die erforderlichen Genehmigungen für den Kieseinsatz ein, die den örtlichen Gesetzen und Vorschriften entsprechen. Dies kann ein zeitaufwändiger Teil des Kultivierungsprozesses sein und muss in den Projektzeitplan integriert werden. Transportieren Sie “grünen Kies” in Tabletts, die mit in Meerwasser getränkten Handtüchern bedeckt sind, um den Seetang hydratisiert zu halten. Legen Sie Tabletts in isolierte Kühlboxen mit Eis und stellen Sie sicher, dass sie nicht in direktem Kontakt mit Eis stehen. Stellen Sie sicher, dass der “grüne Kies” dicht gepackt ist, um ein Rollen der Substrate und eine Ablösung der Sporophyten während des Transports zu vermeiden.HINWEIS: Je nach Platzangebot können die Substrate auch in ihren Kulturbehältern oder Wannen transportiert werden, um die Handhabung zu reduzieren. Transportieren Sie “grünen Kies” für bis zu 6 Stunden in einer schattigen Kühlbox. Der Einsatz sollte zeitlich so gewählt werden, dass die direkteste Sonneneinstrahlung vermieden wird. Verwenden Sie beim Einsatz von einem Boot aus eine schattige Struktur, um direkte Sonneneinstrahlung während des Einsatzes zu vermeiden. Streuen Sie vorsichtig “grünen Kies” von der Oberfläche auf das darunter liegende Riff oder über Tauchen, wenn Sie an neuen Standorten und in kleinem Maßstab testen.

Representative Results

Die Wiederherstellungstechnik des “grünen Kieses” befindet sich noch in der Pilotphase, mit begrenzten Daten zum Überleben von Außenpflanzen für andere Arten28 und noch keine veröffentlichten Daten für Macrocystis pyrifera. Unter Verwendung der Feldsammlung und der Laborwartung, die in diesem Protokoll beschrieben sind, testeten wir die Bedeutung der standortspezifischen Aufzuchtbedingungen für zwei verschiedene Donor-Kelp-Populationen vor dem hypothetischen Einsatz von “grünem Kies” (Abbildung 5). Reproduktives Seetanggewebe wurde in Kalifornien (USA) aus kühleren K1 (Santa Cruz 36,60167°N, 121,88508°W) und wärmeren K4 (San Diego, 32,85036°N, -117,27600°W) Populationen gesammelt und bei zwei Temperaturen aufgezogen: (1) 12 °C (die Standardkultivierungstemperatur für Algenaquakulturen und die mittlere Winter-SST für K1) und (2) 20 °C (die mittlere Sommer-SST für K4, und eine Hitzewelle von 4 °C für K1). Alle Glasobjektträger, die zur Überwachung der Entwicklung des Seetang-Lebenszyklus verwendet wurden, wurden mit einem standardisierten Gitter markiert, und mit diesem Gitter wurden hochauflösende Bilder aufgenommen, um die Beobachtung fester Felder im Laufe der Zeit mit einem inversen Mikroskop und einer Kamera zu ermöglichen (N = 5 Bilder pro Probe, 2,479 mm x 1,859 mm). Nach 24 Tagen nach der Sporulation wurden Gametophyten anhand von Mikroskopbildern gezählt (N = 300 Bilder aus 60 Proben). Um Unterschiede in der Gametophytenzahl zu testen, wurden verallgemeinerte lineare Mixed-Effects-Modelle mit Poisson-Verteilung unter Verwendung der Funktion glmmTMB() im Paket glmmTMB41 verwendet, und paarweise Vergleiche wurden mit emtrends() aus dem Paket emmeans42in R durchgeführt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Reaktion der Gametophyten auf die thermische Variabilität zwischen K1- und K4-Populationen unterschiedlich war (t = 2,7, p = 0,007), wobei die Temperatur keinen Effekt für die wärmere K4-Population hatte (Schätzung = -0,01, Standardfehler [SE] = 0,01, Konfidenzintervall [CI] = [-0,03, 0,01]), aber einen Effekt für die kühlere K1-Population (Schätzung = -0,06, SE = 0,02, CI = [-0,10, -0,03]) (Abbildung 6A), was auf eine mögliche adaptive Divergenz der thermischen Toleranzmerkmale hindeutet. Kelp-Gametophyten werden oft als Resistenzstadium43 dargestellt, was bedeutet, dass sie einen Allzweck-Phänotyp produzieren, der stresstolerant und relativ unempfindlich gegenüber Umweltschwankungen ist. Diese Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass die thermische Variabilität in diesem frühen Stadium einen erheblichen Druck ausübt. Nach 32 Tagen nach der Sporulation wurden sichtbare Sporophyten mit einer Länge von mehr als ca. 1 mm auf der Gesamtheit jedes 2,5 cm x 7,5 cm großen Objektträgers gezählt (N = 72 Gesamtproben). Um Unterschiede in der Anzahl der sichtbaren Sporophyten zu testen, wurden verallgemeinerte lineare Mixed-Effects-Modelle mit Poisson-Verteilung unter Verwendung der Funktion glmmTMB() im Paket glmmTMB und paarweise Vergleiche mit emtrends() aus Paketemmeans in R durchgeführt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Reaktion von Sporophyten auf thermische Variabilität zwischen K1- und K4-differenzierten Populationen (z = 0,92, p = 0,36) ähnlich ist, wobei die Temperatur einen Einfluss auf die wärmere K4-Population (Schätzung = -0,66, SE = 0,04, CI = [-0,74, – 0,57]) sowie die kühlere K1-Population (Schätzung = -0,85, SE = 0,13, CI = [-1,10, -0,60]) hatte (Abbildung 6B). Proben, die bei 20 °C aufgezogen wurden, wuchsen nur wenige sichtbare Sporophyten (Mittelwert ± SE = 0,4 ± 0,2) im Vergleich zu Proben, die bei 12 °C aufgezogen wurden (Mittelwert ± SE = 82,4 ± 9,8). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Sporophytenproduktion temperaturempfindlicher ist als das Gametophytenstadium und dass die standortspezifischen Kultivierungstemperaturen 15 °C nicht überschreiten dürfen, um die Sporophytenentwicklung wie im Protokoll beschrieben zu erreichen. Abbildung 1: Diagramm des Inkubatorsystems “grüner Kies”. (A) Rotlichtquelle für vegetativ aufblähende Gametophytenkulturen. (B) Zugangsöffnung für elektrische Leitungen und Schläuche, die zu einer externen Steckdose führt. (C) Struktur, um Vollspektrumlicht aus dem Rotlichtbereich zu blockieren. (D) Ein “Grünkies”-Anbauabschnitt. (E) Vollspektrum-Lichtquellen. (F) Schlauchleitungen, die an eine externe gefilterte Luftquelle angeschlossen sind. (G) Rückschlagventile zur Reduzierung der Kontamination in der Luft. (H) Einzelne Kulturbehälter, die die Kontamination minimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Diagramm des Wasserbadsystems “Grünkies”. (A) Kühler mit Tauchpumpe (in I). (B) 20-Gallonen-Wanne für Wasserbäder. (C) Abtropfen lassen, um das Wasserbad umzuwälzen. (D) Ventil zur Umwälzung des Wasserbads. (E) Lichtquelle. (F) 2,5-Liter-Behälter “grüner Kies” mit transparentem Deckel und Belüftungsöffnung. (G) Belüftungsquelle. (H) Rohre, die Wasser mit Hilfe von Tauchpumpen umwälzen. (I) Wasserbadabscheider von/zu Kühler von/zu Wannen mit Tauchpumpen. (J) Acrylabdeckung zur Minimierung der Verdunstung im Wasserbad. (K) Netzschirm zur Einstellung der Lichtintensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Entwicklung von Macrocystis pyrifera . Entwicklungsstadien der Lebensgeschichte von Macrocystis pyrifera aus Laborwachstumsversuchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: “Grüner Kies” mit Macrocystis pyrifera. Grüner Kies, der mit Macrocystis pyrifera gesät wird, wird im Labor kultiviert, bis die Sporophyten 1-2 cm erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Experimentelle Zeitreihen. Beispielbilder aus einer Zeitreihe, die das experimentelle Wachstum und die Entwicklung von Macrocystis pyrifera Gametophyten und Sporophyten verfolgt, die aus zwei Populationen stammen, die in Kalifornien (USA) gesammelt und bei zwei verschiedenen Temperaturen kultiviert wurden. K1 = Santa Cruz, K4 = San Diego. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse. Macrocystis pyrifera-Lebensstadien beobachtet für K1 Santa Cruz San Diego K4 Santa Cruz Ursprungspopulationen, kultiviert unter konstanten thermischen Bedingungen von 12 und 20 °C. Fehlerbalken, Mittelwert ± 1 SE. Sternchen (*) kennzeichnet statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05). (A) Gametophyten am Tag 24 (N = 300 Gesamtbilder von 60 Proben). (B) Sichtbare Sporophyten am Tag 32 (N = 72 Proben, innerhalb einer standardisierten Fläche von 2,5 cm x 7,5 cm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Akte 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Der anthropogene Klimawandel ist eine wachsende Bedrohung für die Gesundheit der Weltmeere 44,45,46,47,48 und führt zu großen Störungen und zum Verlust der biologischen Vielfalt 49,50,51,52. Um die Wiederherstellung geschädigter Ökosysteme zu beschleunigen, haben die Vereinten Nationen die Jahre 2021 bis 2030 zur “UN-Dekade zur Wiederherstellung von Ökosystemen” erklärt, die mit der “UN-Dekade der Ozeanforschung für nachhaltige Entwicklung” zusammenfällt, die darauf abzielt, die Verschlechterung der Meeresgesundheit umzukehren⁵³. Im Einklang mit diesem globalen Aufruf zum Handeln hat die Kelp Forest Alliance die Kelp Forest Challenge ins Leben gerufen, um bis zum Jahr 2040 1 Million Hektar Kelpwald wiederherzustellen und 3 Millionen Hektar Kelpwald zu schützen⁵⁴. Die Wiederherstellung von Meeren wird unterschätzt⁵⁵, und Seetang-Ökosysteme erhalten deutlich weniger Aufmerksamkeit als Lebensräume wie Korallenriffe, Mangrovenwälder und Seegraswiesen⁵⁶. Die Wiederherstellung geschädigter Ökosysteme hat sich beim Wiederaufbau mariner Ökosysteme als wirksam erwiesen, kann aber im Durchschnitt zwischen 80.000 und 1.600.000 US-Dollar pro Hektar kosten, wobei die durchschnittlichen Gesamtkosten wahrscheinlich zwei- bis viermal höher sind⁵⁷. Aktuelle und prognostizierte Verluste erfordern die Entwicklung skalierbarer, praktikabler und kostengünstiger Methoden zur Wiederherstellung von Seetang als dringende Schutzmaßnahmen.

Aktuelle Bemühungen zur Wiederherstellung von Seetang verwenden eine Kombination von Methoden, um standortspezifische Treiber des Seetangverlusts anzugehen, einschließlich der Transplantation von erwachsenem Seetang, der direkten Aussaat von Zoosporen und/oder Gametophyten, der Kontrolle von Weidetieren und der Installation künstlicher Riffe¹¹. Diese Methoden erfordern jedoch erhebliche Ressourcen und sind nur begrenzt skalierbar. Die typische Transplantation von erwachsenem Seetang erfordert den mühsamen Einsatz künstlicher Materialien oder Strukturen auf dem Benthos durch Taucher. Bottom-up-Eingriffe zur Wiederherstellung von felsigen Küstenriffen, wie z. B. die Kontrolle von Konkurrenten und Weidetieren, werden ebenfalls durch die Arbeitskosten eingeschränkt, da sie auf der manuellen Entfernung oder dem Ausschluss dieser biotischen Stressoren unter Wasser beruhen¹¹. Die ” Green Gravel”- Technik überwindet diese Einschränkungen durch eine einfache Bereitstellung von der Oberfläche aus, erfordert keine Unterwasserinstallation oder technisches Wissen und Skalierbarkeit zu relativ geringen Kosten²⁸. Dieser innovative Ansatz bietet ein vielversprechendes Wiederherstellungswerkzeug, das umfangreiche Versuche an verschiedenen Orten und Umgebungen erfordert, um sein volles Potenzial auszuschöpfen³².

Während erfolgreiche Wiederherstellungsbemühungen mit “grünem Kies” in geschützten Fjorden in Norwegen mit dem Zuckertang Saccharina latissima²⁶ dokumentiert wurden, befindet sich diese Technik für Macrocystis pyrifera im Ostpazifik noch in der Pilotphase. Zusätzliche Studien sind erforderlich, um die erwartete Überlebensrate von M. pyrifera-Auspflanzungen innerhalb seines Verbreitungsgebiets zu untersuchen. Unter wellenexponierten Bedingungen, die für das Wachstum von M. pyrifera typisch sind, kann kleinerer Kies anfälliger für Bewegung und Abrieb sein, was zu beschädigten Außenpflanzen führt. Darüber hinaus kann ein positiver Auftrieb durch gasgefüllte Pneumatozysten von M. pyrifera dazu führen, dass “Grünkies“-Außengewächse effektiv von der Renaturierungsstelle weggetragen werden, und daher sind Kiesgröße und -gewicht wichtige Faktoren, die es für diese Art zu erforschen gilt. In einer kürzlich durchgeführten Pilotstudie (Mai 2022; Ensenada, Baja California, Mexiko) wurde ein vorläufiger Erfolg im Feld mit M. pyrifera beobachtet, der durch die Anheftung der Haptera an das umgebende Substrat und das Wachstum von Jungtieren angezeigt wird, die nach zwei Monaten im Feld eine Länge von 1,2 m erreichen (Abbildung 4). Dies zeigt eine klare Chance, die noch erforscht werden muss, um “grünen Kies” für M. pyrifera im Ostpazifik zu verwenden. Dieses Video zeigt die Technik des “grünen Kieses” mit M. pyrifera und ist eine wertvolle Ressource, die bestehende Praktiken in der Kultivierungsphase der Wiederherstellung vereinfacht und zentralisiert, um Studien zu unterstützen, die sich mit Erfolgen und Einschränkungen in verschiedenen Feldumgebungen befassen.

Mit der “Grünkies“-Technik können viele kleinere, einzelne Kieseinheiten in einem Umfang ausgesät werden, der die Erfolgswahrscheinlichkeit im Vergleich zu gängigeren Transplantationsansätzen mit erwachsenen Pflanzen erhöhen kann. Der wichtigste skalierbare Aspekt dieser Technik ist jedoch der einfache Einsatz von der Oberfläche aus, der die Wiederherstellung großer Flächen mit dem Boot erleichtern kann. Für Feldumgebungen, in denen der Einsatz von kleinem Kies nicht geeignet ist, kann dieses Protokoll angepasst werden, um M. pyrifera auf einer Vielzahl von Substraten zu verpflanzen, einschließlich größerem Kies oder sogar kleinen Felsbrocken, Schnüren, die an natürlichen oder ausgebrachten Unterwasserankern gebunden werden können, oder Ziegeln, die unter exponierteren Bedingungen mit Meeresepoxidharz auf den Meeresboden geschraubt oder geklebt werden können. Diese Anpassungen des Einsatzes werden die für die Kultivierung von M. pyrifera erforderlichen Einrichtungen nicht ändern, aber in der Folge die Kosten für den Einsatz erhöhen.

Anthropogene Störungen und der Klimawandel überwinden derzeit die Anpassungsfähigkeit natürlicher Populationen. Dies stellt die traditionellen Naturschutzbemühungen, die Ökosysteme wieder in ihren historischen Zustand zurückversetzen, vor erhebliche Herausforderungen 58,59,60,61,62,63. Daher haben sich die Naturschutzrahmen um ein vorausschauendes Management unter Berücksichtigung von Resilienz und Anpassungsfähigkeit erweitert⁶⁴. Ein vorausschauendes Management zur Bekämpfung des Klimawandels wird für Baumarten in Waldökosystemen implementiert⁶⁵ und wurde für weitere Wiederherstellungsbemühungen vorgeschlagen, um das evolutionäre Potenzial von Außenpflanzen zu verbessern^66,67. Obwohl diese Strategien in terrestrischen Umgebungen von Natur aus leichter zu handhaben sind, beginnen mehrere Studien, ihre Anwendung in marinen Umgebungen zu untersuchen 62,68,69,70. Zum Beispiel sind Korallenriffe durch zahlreiche anthropogene Stressoren bedroht, die zu einem beispiellosen Rückgang geführt haben ^71,72. Als Reaktion auf den Verlust dieser wichtigen Grundarten werden zunehmend aktive Wiederherstellungs- und Anpassungstechniken befürwortet, um die verbleibenden Korallenriffe und die damit verbundenen Funktionen zu erhalten 62,73,74. Eine Technik besteht darin, Individuen innerhalb ihres aktuellen Verbreitungsgebiets umzusiedeln, um die Toleranz gegenüber Hitzestress zu erhöhen⁷⁵. In Bezug auf die Wiederherstellung von Kronendach-bildenden Seetang verfügt “grüner Kies” über einen anpassbaren Rahmen, um unterstützte Anpassungstechniken wie die Translokation widerstandsfähiger Genotypen in gefährdete Gebiete, nicht-genetische Manipulation wie Hybridisierung oder Akklimatisierung von Individuen an Umweltstress^{zu erforschen 62} mit Ergebnissen, die darauf abzielen, widerstandsfähigere Stämme für Wiederherstellungsprogramme zu erhalten^76,77.

Die Nutzung lokaler Unterstützung zur Verbesserung der Wiederherstellungsbemühungen ist entscheidend für den nachhaltigen Erfolg des Kelp-Ökosystems. Die Einbeziehung lokaler Interessengruppen kann die lokale Akzeptanz für den Wiederherstellungsbedarf^{erhöhen 6,50} und die Küstenverwaltung fördern, was in der Folge zu einer erhöhten Finanzierung und Langlebigkeit des Schutzes des Seetang-Ökosystems führen könnte. Wie bei allen anderen Methoden zur Wiederherstellung von Seetang werden strukturierte Entscheidungsrahmen, die verschiedene ökologische, sozioökonomische und Naturschutzziele integrieren, dazu beitragen, optimale Ergebnisse für Seetang-Ökosysteme und die von ihnen unterstützten Gemeinschaften zu erzielen¹¹.

Materials

0.22 µm filters	Milipore	SCGPS05RE	Natural seawater sterilization
1 L glass bottles	Amazon	B07J6JP4D1	Natural seawater sterilization
1 µm filters (water + air)	Amazon	B01M1VWUWL	Natural seawater sterilization
1'' PVC 90-Degree Elbow	Home Depot	203812125	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
10 µm filters	Amazon	B00D04BG56	Natural seawater sterilization
20 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
3x5mm tubing	Amazon	B0852HXPN6	Option 1 Small scale – Incubator
4×4'' Sterile Gauze	Amazon	B07NDK8XM3	Sporulation
4x6mm tubing	Amazon	B08BCRV1FY	Option 1 Small scale – Incubator
5 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
50 mL falcon tubing	Amazon	B01M04HGPJ	Sporulation
8x10mm tubing	Amazon	B01MSM3LLZ	Option 1 Small scale – Incubator
Air filters	Thermo Fisher	MTGR85010	Option 1 Small scale – Incubator
Alcohol lamp	Amazon	B07XWD9WWC	Sporulation
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99%	Sigma	215406-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Aquarium Grade Gravel	Amazon	B07XRCKFBJ	Option 1 Small scale – Incubator
Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99%	Sigma	B4639-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g	Thermo Fisher	5090113707	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA	Thermo Fisher	P001225G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Check valves	Amazon	B08HRZR4MM	Option 1 Small scale – Incubator
Clear tubing 3/8'' – 10 ft	Amazon	B07MTYMW13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING – California – Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA	Thermo Fisher	5090114752	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Compound microscope with camera	OMAX	M83EZ-C50S	Monitoring
Culture flask	Thermo Fisher	07-250-080	Option 1 Small scale – Incubator
Culture light	Amazon	B07RRRPJ63	Option 1 Small scale – Incubator
Culture stoppers	Amazon	B07DX6J7QD	Option 1 Small scale – Incubator
Drainage connector	Amazon	B00GUZ6CV0	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2	Thermo Fisher	50213299	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL	Thermo Fisher	S81273	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL	Thermo Fisher	S81275	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets – Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye	Thermo Fisher	S81271	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Filter holder	Amazon	B07LCKBKCT	Natural seawater sterilization
Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA	Thermo Fisher	S63460	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
FLEXACAM C1 Camera	Leica	FLEXACAM C1	Monitoring
Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN	Thermo Fisher	AAJ6083314	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Free Standing 20 Gallon Utility Sink	Amazon	B094TLH19L	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR	Thermo Fisher	AC190000100	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA	Thermo Fisher	S88442	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass slides	Amazon	B00L1S93PS	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture	Sigma	G6501-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid	Container store	#10014828	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Growth light	Amazon	B086R14MFW	Option 1 Small scale – Incubator
Hemocytometer	Amazon	B07TJQDKLJ	Sporulation
HEPES 99.5% (titration)	Sigma	H3375-500G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Hinged plastic jars	SKS Bottle & Packaging	40280125.01S	Option 1 Small scale – Incubator
Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size – 100G Storage Conditions – +15 C TO +30 C Catalog Number – 26310.01 CAS 87-89-8	Thermo Fisher	50247745	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Instant Ocean – 50 G	Amazon	B000255NKA	Option 1 Small scale – Incubator
Inverted Microscope Leica DMi1	Leica	DMi1	Monitoring
Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97%	Sigma	236489-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Licor Ligth Meter Data Logger	Licor	LI-250A	Monitoring
Light/temperature HOBO data logger	Amazon	B075X2SWKN	Monitoring
Lights 150W	Amazon	B0799DQM9V	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications	Sigma	M8179-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds	Home Depot	206823930	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11,	Thermo Fisher	AAA1268330	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA	Thermo Fisher	ICN10256925	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
PCV cement	Amazon	B001D9WRWG	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B0006JLVE4	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B07G5FY7X1	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Precision scale 1mg	Amazon	B08DTH95FN	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Pump for filtered air	Amazon	B0BG2BT9RX	Option 1 Small scale – Incubator
PVC tubing 1×24''	Home Depot	202300505	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Quantum Light meter	Apogee Instruments	MQ-510	Monitoring
Refrigerated Incubator	Thermo Fisher	15-103-1566	Option 1 Small scale – Incubator
Rubber Grommets	Amazon	B07YZD22ZP	Option 1 Small scale – Incubator
Salinity refractometer	ATC	B018LRO1SU	Monitoring
Shade mesh 6×50 ft	Home depot	316308418	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA	Thermo Fisher	BP360500	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Soldering for aeration opening	Amazon	B08R3515SF	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Spray isporopyl alcohol	Amazon	‎ B08LW5P844	Sporulation
Stainless steel sissors	Amazon	B07BT4YLHT	Sporulation
Stainless steel tray	Amazon	B08CV33YXG	Sporulation
Stainless steel twizzers	Amazon	B01JTZTAJS	Sporulation
Stir Bars	Amazon	B07C4TNKXB	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Submersible circulation pump 400 GPH	Amazon	B07RZKRM13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Submersible Spherical Quantum Sensor	Waltz	US-SQS/L	Monitoring
Temperature gun	Infrared Thermometer 749	B07VTPJXH9	Monitoring
Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture	Sigma	T1270-25G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA	Thermo Fisher	AC157850250	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Transparent Acrylic sheet 24×48 inch	Home Depot	202038048	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Tubing water circulation 1''x10 ft	Amazon	B07ZC1PSF3	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
UV light for natural seawater sterilization	Amazon	B018OI7PYS	Natural seawater sterilization
Vacum pump	Amazon	B087XBTPVW	Natural seawater sterilization
Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98%	Sigma	V6629-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA	Thermo Fisher	S89446	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA	Thermo Fisher	S89445	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Water Chiller 200-600GPM	Amazon	B07BHHP71C	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Y-splitters for 4x6mm tubing	Amazon	B08XTJKFCH	Option 1 Small scale – Incubator
Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture	Sigma	Z0251-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment