Feltindsamling og laboratorievedligeholdelse af baldakindannende kæmpetang for at lette restaurering

Summary

Denne protokol beskriver feltindsamling og regelmæssig laboratorievedligeholdelse af substrater podet med baldakindannende kæmpetang til brug i restaureringsforsøg for at imødegå succesen og begrænsningerne ved ‘grøn grus‘ -teknikken i markindstillinger.

Abstract

Baldakindannende tang er vigtige grundarter, der understøtter biodiversitet og leverer økosystemtjenester til en værdi af mere end USD 500 milliarder årligt. Den globale tilbagegang for gigantiske kelpskove på grund af klimadrevne økologiske stressfaktorer understreger behovet for innovative genopretningsstrategier. En ny restaureringsteknik kendt som ‘grøn grus‘ sigter mod at så unge kelps over store områder uden omfattende undervandsarbejde og repræsenterer et lovende restaureringsværktøj på grund af omkostningseffektivitet og skalerbarhed. Denne videoartikel illustrerer en protokol og værktøjer til dyrkning af kæmpetang, Macrocystis pyrifera. Det giver også en ressource til yderligere undersøgelser for at løse succeserne og begrænsningerne ved denne metode i feltindstillinger. Vi skitserer felt- og laboratoriebaserede metoder til indsamling af reproduktivt væv, sporulating, podning, opdræt, vedligeholdelse og overvågning af substrater, der er sået med tidlige livsstadier ved hjælp af ‘grøn grus’ -teknikken. Protokollen forenkler og centraliserer nuværende restaureringspraksis på dette område for at støtte forskere, ledere og interessenter i at opfylde kelpbevaringsmål.

Introduction

Baldakindannende tang (brune makroalger i rækkefølgen Laminariales) er globalt vigtige grundarter, der dominerer kystnære stenrev i tempererede og arktiske have¹. Disse tang danner strukturelt komplekse og yderst produktive biogene levesteder kendt som kelpskove, der understøtter taksonomisk forskellige marine samfund². Kelpskove over hele verden leverer mange økosystemtjenester til mennesker, herunder kommerciel fiskeriproduktion, kulstof- og næringsstofkredsløb og rekreative muligheder med en samlet anslået værdi på USD 500 milliarder om året³.

På trods af deres betydelige værdi står kelpskove over for voksende menneskeskabte pres i mange regioner³. Klimaændringer udgør en af de største trusler mod tang på grund af langvarig havopvarmning kombineret med den stigende hyppighed af temperaturanomalier 3,4,5,6,7. Øgede havtemperaturer er forbundet med næringsstofbegrænsning⁸, mens eksponering for varmestress over fysiologiske tærskler kan resultere i dødelighed⁹. I kombination med variable regionale lokale stressfaktorer⁷ falder tangpopulationerne globalt med ca. 2% om året¹⁰ med betydelige tab og vedvarende skift til alternative samfundsstater i visse regioner 6,11,12,13,14. Naturlig genopretning af tangpopulationer alene er muligvis ikke tilstrækkelig til at vende omfanget af nuværende og forventede tab 15,16,17,18, hvilket understreger vigtigheden af aktiv genopretning.

Nuværende kelprestaureringsindsats kan bruge en kombination af metoder til at genoprette disse vigtige grundarter på kystnære stenrev ^3,19. De metoder, der vælges til at løse lokalitetsspecifikke problemer, afhænger af den geografiske kontekst, de specifikke hindringer for genopretning af tang og den socialøkologiske kontekst¹¹. Nøglen til at forstå forbindelserne og den indbyrdes afhængighed mellem socialøkologiske systemer er, og interventioner, der engagerer lokale institutioner og får støtte fra lokalsamfundene, øger sandsynligheden for en vellykket genopretningsindsats²⁰.

Ud over klimaændringer driver, reducerer eller undertrykker planteædende pres eller interspecifik konkurrence genopretningen (f.eks. ved søpindsvin¹³, planteædende fisk^21,22, græsalger ^9,23 eller invasive alger ²⁴). Restaurering kan fokusere på fjernelse af disse biotiske stressorer²⁵, selv om disse metoder kræver betydelige ressourcer og løbende vedligeholdelse¹¹. For at katalysere genopretning af kelparter har der været bestræbelser på en direkte såningsmetode, for eksempel vejning af maskeposer fyldt med frugtbare kelpblade til benthos, der frigiver zoosporer i miljøet²⁶. Denne metode er imidlertid tidskrævende og kræver teknisk undervandsinstallation og fjernelse. Andre tilfælde fokuserer på transplantation af store mængder hele voksne donorplanter, hvilket kan kompromittere nært forbundne og sårbare donorpopulationer og ofte er begrænset til små skalaer på grund af afhængighed af kontinuerlig transplantation²⁷.

For regioner, hvor begrænsning af kelpsporer kan hindre genopretning af kelpskov på grund af fragmentering af levesteder, blev der indført en relativt ny tanggendannelsesmetode kaldet ‘grøn grus’-teknik. Teknikken blev med succes afprøvet på Flødevigen Research Station i Sydnorge²⁸ og repræsenterede en lovende mulighed for restaurering på grund af omkostningseffektivitet og skalerbarhed. Arbejdsprocessen for denne teknik er som følger: (1) en sporeopløsning er skabt af frugtbart væv opsamlet fra reproduktive voksne kelps i marken og derefter podet på små substrater, såsom grus; (2) tang i tidlige stadier opdrættes under laboratoriekontrollerede abiotiske forhold på substrater; (3) Substrater med synlige sporofytter anvendes i marken på specifikke rev som »grønt grus«, hvor sporofytter fortsætter med at vokse. Bemærk, at typiske transplantationsbestræbelser hos voksne individer kræver besværlig og omkostningshæmmende undervandsinstallation af dykkere, og teknikken ‘grøn grus‘ bruger enkel implementering fra overfladen²⁸.

Teknikken med ‘grønt grus’ afprøves i øjeblikket af medlemmer af adskillige internationale arbejdsgrupper²⁹ på tværs af forskellige miljøer og flere laminære tangarter. Denne protokol beskriver de nødvendige faciliteter, materialer og metoder til vævsindsamling, sporulation, såning, opdrætsbetingelser, regelmæssig vedligeholdelse og overvågning af tang i det tidlige stadium, inden denne restaureringsteknik anvendes i marken ved hjælp af kæmpetangen, Macrocystis pyrifera. Denne protokol er en værdifuld ressource for forskere, ledere og interessenter, der søger at give indsigt i succeserne og begrænsningerne ved denne metode med M. pyrifera i forskellige feltindstillinger.

Protocol

Kelpvæv, der anvendes som beskrevet i denne protokol, blev indsamlet og overvåget af California Department of Fish and Wildlife under tilladelse S-202020004-20205-001. 1. Forberedelse af faciliteter og materialer Sørg for, at tangdyrkningsanlæg kan opretholde temperaturen (10-15 °C), give fuldspektret lys (0-180 μmol fotoner m-2 s-1) og filterluftning (0,2 μm porestørrelse). Brug inkubatorsystemer med en indbygget stikkontakt eller en adgangsport til ledninger og slanger, lys og en luftkilde (figur 1). Hvis et inkubatorsystem ikke er inden for projektets omfang, budget eller tilsigtede skala, skal du bruge vandbade hærdet med køligt, naturligt havvand eller en køler (figur 2). Se materialefortegnelsen for specifikke detaljer.Anbring et termometer i vækstmediet eller brug en temperaturpistol for at sikre, at temperaturen er mellem 10-18 °C.BEMÆRK: Opdrætstemperaturer er sted- og sæsonspecifikke30. Programmér fuldspektret lys til en fotoperiode på 12 timers lys: 12 timer mørkt ved at ændre timingindstillingerne på lyskilden eller ved at bruge en mekanisk timer. Lysintensiteten måles med et vandtæt fotosyntetisk aktivt strålingskvantemeter (PAR) under overfladen nær gruset, og der justeres ved hjælp af en dæmpbar lyskilde eller ved lagdeling af cellofan (i tilfælde af vegetativ gametofytdyrkning, se afsnit 9) eller maske over lyskilden (for nærmere oplysninger om lysintensitetsjusteringer, se afsnit 6.3). Sørg for korrekt beluftning ved hjælp af luftpumper31 en dag efter sporulation. Brug filtre (0,2 μm porestørrelse) for at reducere luftbåren bakteriel kontaminering.BEMÆRK: Ved dyrkning af »grønt grus« skal beluftningstrykket være tilstrækkeligt til at cirkulere vand i alle dyrkningsbeholdere uden at forstyrre fastgørelsen af tang i et tidligt stadium til frøede substrater. Hvis der er bulking gametofytbiomasse (se pkt. 9.2), skal beluftningstrykket være tilstrækkeligt til at holde gametofytter suspenderet i dyrkningsmediet. Steriliser materialer og stationer. Forbered disse på forhånd (se materialetabel).Rengør overflader med 70% isopropylalkohol. Håndter reproduktivt sorivæv og rengør opsamlingsudstyr uden for børnehaven ‘grønt grus’, hvis det er muligt. Brug følgende steriliseringsmetoder: skyl med et vaskemiddel af laboratoriekvalitet efterfulgt af en grundig skylning med destilleret vand, blød i en fortyndet blegemiddelopløsning (i henhold til producentens anvisninger) efterfulgt af en grundig skylning med destilleret vand og autoklave ved hjælp af passende indstillinger (glasvarer eller instrumenter). Efter sterilisering kan materialer opbevares i en forseglet beholder eller indpakkes med folie. Skrub og rengør beholdere med lågene, der skal bruges til dyrkning, ved hjælp af et rengøringsmiddel i laboratoriekvalitet efterfulgt af en grundig skylning med destilleret vand.BEMÆRK: Kulturbeholdere med låg hjælper med at reducere fordampningen af vækstmedier. Lad lågene stå let åbne for at muliggøre luftudveksling, eller brug en kontraventil til at reducere luftbåren forurening. Hvis lågbeholdere ikke er tilgængelige, forsegles kulturbeholdere med termoplast, såsom paraffinfilm, og der foretages 2-3 perforeringer. Hvis der anvendes større tanke, skal du bruge anti-fordampningsdæksler lavet af gennemsigtig plast. Sørg for, at grus har en struktureret eller let pitted overflade, da gametofytter er mere tilbøjelige til at blive tilbageholdt på underlag med en høj rugositet32,33. Skrub og skyl grus, indtil vandet løber klart for at fjerne støv eller snavs. Grus lægges i blød i en 10% fortyndet blegemiddelopløsning i mindst 24 timer og skylles med filtersteriliseret havvand (se pkt. 2.1). Alternativt, efter skrubning og skylning, blød grus i 1 uge i deioniseret (DI) vand32.BEMÆRK: Ideelt set anvendes lokalt høstet substrat til at reducere forurening af restaureringsstedet. Alternativt anbefales grus af akvariekvalitet. Undgå kalkholdige substrater som kalksten, som kan føre til vævsblegning og efterfølgende dødelighed af transplanterede tang32. 2. Forberedelse af vækstmedier Filtrer og steriliser havvand i henhold til følgende metoder, afhængigt af ressourcetilgængelighed. Beregn mængden af filtersteriliseret havvand, der er nødvendig for at opdatere kulturbeholdere hver uge (se afsnit 7), og planlæg denne filtrerings-/steriliseringsopgave i overensstemmelse hermed. Opbevar store partier filtersteriliseret havvand i mørke beholdere i op til 6 måneder ved 8-10 °C. Hvis køling ikke er tilgængelig, skal den opbevares i et mørkt, køligt område.Filtrer vand ved hjælp af et vakuumfiltreringssystem med en porestørrelse på 0,55-1 μm. Sluk for vakuumkilden, før alt vandet trækkes igennem for at undgå at beskadige filteret, og hæld det filtrerede vand i en dedikeret steril beholder. For større mængder skal du bruge et gennemstrømningsfiltreringssystem. Kør f.eks. havvand gennem en serie på tre plisserede filtre (10 μm, 5 μm og 1 μm) arrangeret fra største til mindste porestørrelse.BEMÆRK: Hvis naturligt havvand ikke er tilgængeligt, kan kunstigt havvand fremstilles. Alternativt kan naturligt havvand købes fra akvarieforretninger, i bulk og filtreres ofte, desinficeres og pH-afbalanceret. Medieberigelse er stadig nødvendig for disse muligheder. Steriliser filtreret havvand ved hjælp af UV- og/eller autoklaveringsmetoder. Tilslut gennemstrømningssystemer til et akvarium UV-lys med en strømningshastighed anbefalet af producenten. Autoklave havvand i autoklavesikkert glas med let åbne låg eller dækket med folie og på en væskecyklus (121 ° C; 1-2 PSI, 15-30 min afhængigt af væskevolumen34.BEMÆRK: Autoklavering af filtreret havvand anbefales til de tidlige stadier af kulturen. Berigelse af filtersteriliseret havvand med næringsstoffer og vitaminer er afgørende for M. pyrifera vækst. Provasoli Enriched Seawater media (PES) er et meget anvendt medie designet til algekulturer35. Køb dette medie fra algekulturcentre. Forberedelser af PES og yderligere vitaminer til M. pyrifera vækst er beskrevet i34.Berig hver 1 liter filtreret havvand med 20 ml PES. Alternativt kan du bruge dyrkningsmedier på industrielt niveau. Opbevar berigelsesløsninger i henhold til producentens anbefalinger. Berig filtersteriliseret havvand, når vækstmedier er nødvendige for at undgå nedbrydning af berigelsesopløsninger. 3. Indsamling i marken Bestem tidspunktet for sporofylsamlinger for at efterligne den naturlige reproduktive cyklus af lokale M. pyrifera-populationer. Kontakt lokale eksperter (f.eks. Kelpforskere, ledere, økologer, borgerforskere, dykkergrupper) for at sikre passende timing for sporofylindsamling. Få de nødvendige tilladelser til kelpvævsopsamling, der opfylder lokale love og regler. Dette kan være en tidskrævende del af dyrkningsprocessen og skal indarbejdes i projektets tidslinjer. Ved selvstændigt undervands åndedrætsværn (SCUBA) til at vælge 3-5 sporofylblade fra 10-15 frugtbare M. pyrifera individer med synlig sori, fordelt mindst 2 m fra hinanden. Vælg rene og intakte sporofyler, hvis det er muligt, med ringe eller ingen tilsmudsning eller nedbrydning. Opbevar sporofylblade separat i henhold til forældrepersonen fra dette tidspunkt.BEMÆRK: Sporofyler vokser i et tæt “nederdel” ved bunden, over holdfast af den voksne tang, og kan identificeres ved deres mangel på gasfyldte pneumatocyster1. Ældre sorusvæv er ofte lidt hævet og mørkere i farven end omgivende væv1. Transport sporofylblade i mørke opsamlingsposer for at undgå overeksponering for sollys med minimalt havvand fra stedet for at holde vingerne våde, og opbevar dem i kølere ved ca. 12 °C, indtil de ankommer til dyrkningsområdet. Sørg for, at prøverne ikke er i direkte kontakt med is.BEMÆRK: Sporofyler kan sendes til eller fra andre steder.Skyl sporofyller med havvand. Pak knive, opsamlet fra et enkelt M. pyrifera-individ , i fugtige papirhåndklæder gennemblødt i havvand og igen i aluminiumsfolie for at undgå lysindtrængning og yderligere udtørring36. Denne opbevaringsmetode er almindeligt kendt som “burrito-metoden”. Placer disse pakker i en køler med is med en beskyttende barriere såsom genanvendt bobleplast eller pap. Forbered køleren til forsendelse natten over. Sørg for, at nogen er tilgængelig til at modtage forsendelsen, og placer pakkerne under køleforhold. 4. Sporulation Hvis det er muligt, behandles sporofyler i et temperaturkontrolleret miljø mellem 10-15 °C og væk fra andre kulturer. Forbered og steriliser instrumenter og stationer på forhånd. Brug beskyttelseshandsker ved håndtering af kelpvæv for at reducere forurening. Opbevar eventuelt sporofyler i 12-48 timer under nedkølede forhold, hvilket tilskynder til frigivelse af sporer fra sorusvæv37. Brug “burrito-metoden” beskrevet i afsnit 3.3 til opbevaring. Vælg modent sorusvæv og skær det i 25 cm2 sektioner ved hjælp af steril saks. Vælg 1-2 rene sori-sektioner fra 10-15 individuelle kelpforældre for at fremme genetisk mangfoldighed.BEMÆRK: Hvis opbevaret, skal du eventuelt finde tegn på delvis sporulation på papirhåndklæderne, hvilket indikerer tilstedeværelsen af frugtbart sorusvæv. Sorusvæv er ofte lidt hævet og mørkere i farven end omgivende væv. For at rengøre, skrub forsigtigt begge sider af sorusvævet i en retning kun med en steril gasbind dæmpet med filtersteriliseret havvand. Skrab om nødvendigt sorusvævet forsigtigt med et sterilt barberblad for helt at fjerne tilsmudsning. Nedsænk sori-sektionen i et ferskvandsbad i 30 sekunder til 1 min og skyl med filtersteriliseret havvand.BEMÆRK: Opdater ferskvandsbadet og steriliser de anvendte materialer, når du håndterer forskellige sori-sektioner fra forskellige individer for at reducere krydskontaminering. Nedsænk hver sori-sektion i filtersteriliseret havvand hærdet til 10-15 °C i et sterilt 50 ml centrifugeglas. Anbring rør ved 4-12 °C i mørke for at sporulere i højst 4 timer. Hvis et køleskab ikke er tilgængeligt, skal du opbevare det i et køligt område med svagt lys.BEMÆRK: Alternativt kan sori-sektioner sporuleres i en enkelt, steril beholder. Brug et sammensat mikroskop og hæmocytometer til at observere sporetætheden af 3-4 prøver hvert 30. minut op til 4 timer. Skift pipettespidser mellem prøverne. Hvis densiteten er mindst 10.000 sporer ml-1 (se pkt. 5.1.1), skal du gå videre til næste trin. Hvis en sori-sektion ikke producerer sporer efter 4 timer, kasseres prøven. Sporer kan slå sig ned inden for få timer efter frigivelsen, men kan observeres svømme i en cirkulær bevægelse. Fjern hver sori-sektion fra rørene med steril pincet. Kombiner de resulterende sporeopløsninger i en enkelt, steriliseret beholder og kvantificer den endelige kombinerede densitet. 5. Podning Beregn det endelige volumen sporeopløsning, der er nødvendigt til podning. Sørg for, at den endelige koncentration er ca. 500-1.000 sporer ml-1 i dyrkningsbeholdere.For at beregne koncentrationen af den kombinerede sporeprøve fra tællinger af hæmocytometerets midtergitter divideres tællingen med 10-4 ml (repræsenterer volumenet af opløsning set i hæmocytometeret). For at bestemme volumenet af sporeopløsningen, der skal tilsættes til hver beholder, skal du bestemme mængden af vækstmedier, der er nødvendige for at nedsænke substrater i kulturbeholdere. For at finde det samlede antal sporer i hver beholder multipliceres dette havvandsvolumen med den ønskede koncentration. For at bestemme det totale volumen af sporeopløsning, der skal tilsættes, divideres den samlede mængde sporer med koncentrationen af sporer pr. ml i sporeopløsningen. Anbring sterile glasglas i kulturbeholdere for at overvåge tangudviklingen. Der skal være mindst 30 tilfældigt fordelt dias på kulturbeholdere for at sikre tilstrækkelig overvågning (se nærmere oplysninger i afsnit 7). Pod det beregnede volumen sporeopløsning i dyrkningsbeholderen ved hjælp af en steril pipettespids, der indeholder substrater nedsænket i vækstmedier. Luk beholderen og rør forsigtigt for at fordele sporer. Forsegl og placer beholderen i kultursystemet. 6. Opdræt betingelser Indstil temperaturen mellem 10-15 °C baseret på temperaturen på implementeringsstedet. Efter 1 dag skal du give let beluftning med en filtreret luftkilde. Indstil fuldspektret LED-lys til vandplanter til en 12 timers lys: 12 timers mørk cyklus med lysintensiteter mellem 0-180 μmol foton m-2 s-1:Indstil lysintensiteten til 5-10 μmol foton m-2 s-1 fra 0-1 dag og øg til 20 – 30 μmol foton m-2 s-1 gennem slutningen af 1 uge. Fra dette tidspunkt øges bestrålingen med 10-20 μmol foton m-2 s-1 hver 3-4 dag, indtil der opnås en bestråling på 180 μmol foton m-2 s-1 i slutningen af 6 uger. Fortsæt til bagkulturer ved 180 μmol foton m-2 s-1 gennem slutningen af 8 uger, eller når sporofytter har nået ca. 1-2 cm i længden. 7. Overvågning Overvåg mindst to tilfældige glasglas dagligt/hver anden dag i de første to uger for at vurdere udviklingen.For at overvåge skal du håndtere diaset med steriliseret pincet og placere det i en ren petriskål, der indeholder nok steriliseret havvand til at nedsænke glasrutschebanen. Returner ikke glasglas til kulturer efter fjernelse for at undgå krydskontaminering. Brug et sammensat eller omvendt mikroskop ved 40-400x forstørrelse til at observere tang i det tidlige stadium. Følg udviklingen med følgende tidslinje (se figur 3for eksempler på udviklingsmæssige livshistoriske stadier).BEMÆRK: Aflejrede sporer observeres ved 0-1 d. Sporer kan spire inden for få timer, som det fremgår af dannelsen af et kimrør. Spiring observeres typisk ved 1-2 d. Tidlige gametofytter observeres typisk ved 1-4 d. Gametogenese, den proces, hvorved celler gennemgår opdeling og differentiering for at danne mandlige og kvindelige kønsceller, observeres typisk inden for de første to uger. Kvindelige celler er 5-7 gange større end mænd. Mandlige gametofytter vokser tynde, trådformede grene, mens kvinder er mere runde eller ovale i form. Kvinder producerer typisk æg eller æg inden for 2-3 uger. Sperm frigivet fra mændene svømmer til hunnerne og befrugter æggene, hvilket resulterer i dannelsen af diploide zygoter. At have den rigtige podningstæthed vil sikre en vellykket reproduktion ved nærhed38,39. Befrugtede æg udvikler sig til embryonale sporofytter. Sporofytter observeres typisk inden for 2-4 uger. Zygoten gennemgår hurtig celledeling, hvilket resulterer i vækst af 1-2 cm blade inden for ca. 6-8 uger. Efter to uger skal du overvåge mindst to tilfældige glasdias 1-2 gange ugentligt for sund vækst og forurening, indtil sporofytter når 1-2 cm i størrelse.BEMÆRK: Sund vækst er kendetegnet ved gyldenbrun (i modsætning til grøn eller gennemsigtig) farve. Der er flere kvantitative målinger, der kan observeres på glasglas med et omvendt mikroskop, herunder overlevelse, spiringshastighed, vegetativ udvikling, reproduktiv modenhed og fecundity og kønsforhold40. Vurder forurening med bakterier, svampe, ciliater og kiselalger med et mikroskop. Fjern isoleret forurening. Kontroller tidlige tegn på kiselalger kontaminering med germaniumdioxid (GeO2) (se pkt. 8.3). 8. Vedligeholdelse Juster lysforholdene i henhold til punkt 6.3. Skift vækstmedier hver uge for at genopbygge de nødvendige næringsstoffer og mineraler til M. pyrifera-vækst .Afkøl friske vækstmedier til den passende temperatur. Sørg for, at temperaturen ikke overstiger 15 °C under denne proces. Sifonmedier ud af dyrkningsbeholderne for at undgå at forstyrre frøede substrater. Lad mediet tømmes, indtil beholderen er næsten tom. Opdater medier med det samme for at minimere udtørring. Når du genopfylder vækstbeholdere, skal du vippe dem lidt, så mediet løber ned ad siden af dyrkningsbeholderen for at forstyrre underlagene minimalt. Omarranger tilfældigt beholder- eller karpositioner under ugentlige medieskift for at tage højde for forskelle i lysindstråling.BEMÆRK: Se supplerende fil 1 for en kalender til at spore aktiviteter og forventninger til makrocystiskulturer. Det angiver tidspunktet for justeringer af lys og beluftning samt ugentlige medieændringer. Eventuelt kontrollere diatomekontaminering med en behandling af germaniumdioxid (GeO2). Tilsæt 0,3-0,5 ml 250 mg / mlGeO2 til hver 1 liter havvand, der tilsættes de frøede substrater for at reducere udbredt kiselalgering.BEMÆRK: GeO2 kan hæmme produktionen af algegameter. Påfør en behandling afGeO2 i det korte vindue efter spiring og før toppe af æg- og sædproduktion (1-7 d) og/eller efter ægbefrugtning og sporofytobservationer (>21 d), efterfulgt af et medieskift 48 timer efter for at fjerne kemikaliet. Disse tidslinjer kan variere afhængigt af dyrkningsforholdene, så overvågning af livsfaseudvikling med mikroskopi er den bedste måde at vurdere tidspunktet for GeO2-applikation på. Hvis diatomeforurening vedvarer i kulturbeholdere, og der observeres overvækst på kelps i det tidlige stadium, skal du overveje at genplante substraterne. 9. Kæmpe kelp vegetativ gametofyt dyrkning Formere gametofytkulturer under vegetative forhold året rundt for at reducere afhængigheden af sæsonbestemt sporofylsamling fra det naturlige rev.Gametofytkulturer opbevares i henhold til kildepopulationen i kolber fyldt med vækstmedier ved 4-12 °C i rødt lys ved en intensitet på 5-20 μmol foton m-2 s-1 i en 12 lys: 12 mørk cyklus. Sørg for konstant beluftning og skift medier hver 2-6 måned. For at samle biomasse af gametofytter, der har vokset aseksuelt til brug i ‘grøn grus’ såning, skal du øge beluftningen for at suspendere gametofytter, øge hyppigheden af medieskift til ugentligt og fragmentere gametofytter hver anden uge.Gametofytbiomassen suspenderes i målekolben ved omrystning eller omrøring, og kolbens sider skrabes om nødvendigt med et sterilt værktøj til løsrivelse af påsatte gametofytter. Hæld de suspenderede gametofytter i en steril blender eller kaffekværn og puls gametofytopløsningen i 1-2 s ca. 5-15 gange, afhængigt af biomassekoncentrationen, indtil ingen klumpede masser er synlige. For at fremkalde reproduktion til såning af »grønt grus« fragmenteres gametofytter som forklaret ovenfor. Derefter, pod substrat og øg fuldspektret LED-lys fra 5-20 til 45-60 μmol foton m-2 s-1 (+10 μmol foton m-2 s-1 dagligt til fotoakklimatisering), øg derefter med 10-20 μmol foton m-2 s-1 hver 3-4 d, indtil du når en bestråling på 180 μmol foton m-2 s-1. 10. Implementering Efter 6-8 ugers laboratoriedyrkning skal du sørge for, at unge sporofytter er 1-2 cm lange og klar til indsættelse (figur 4). Opdater vækstmedier i kulturbeholdere 24 timer før udrulning. Få de nødvendige tilladelser til grusanvendelse, der opfylder lokale love og regler. Dette kan være en tidskrævende del af dyrkningsprocessen og skal indarbejdes i projektets tidslinjer. Transport ‘grønt grus’ i bakker dækket med håndklæder gennemblødt i havvand for at holde tangen hydreret. Placer bakker i isolerede kølere med is, og sørg for, at de ikke er i direkte kontakt med is. Sørg for, at det ‘grønne grus’ er tæt pakket for at undgå rullning af underlagene og sporofytløsning under transport.BEMÆRK: Afhængigt af pladstilgængeligheden kan substrater også transporteres i deres kulturbeholdere eller kar for at reducere håndteringen. Transport ‘grønt grus’ i op til 6 timer i en skyggefuld køler. Implementeringen skal være tidsindstillet for at undgå det mest direkte sollys. Hvis du implementerer fra en båd, skal du bruge en skyggefuld struktur for at undgå direkte sol under implementeringsprocessen. Spred forsigtigt ‘grønt grus’ fra overfladen på revet nedenfor eller via SCUBA, når du prøver på nye steder og i små skalaer.

Representative Results

Restaureringsteknikken med “grønt grus” er stadig i pilotfasen med begrænsede overlevelsesdata for andre arter28 og endnu ingen offentliggjorte data for Macrocystis pyrifera. Ved hjælp af feltindsamling og laboratorievedligeholdelse, der er skitseret i denne protokol, testede vi betydningen af stedspecifikke opdrætsforhold for to forskellige donortangpopulationer før hypotetisk ‘grøn grus’ implementering (figur 5). Reproduktivt tangvæv blev indsamlet i Californien (USA) fra køligere K1 (Santa Cruz 36.60167 ° N, 121.88508 ° W) og varmere K4 (San Diego, 32.85036 ° N, -117.27600 ° W) populationer og opdrættet ved to temperaturer: (1) 12 °C (standarddyrkningstemperaturen for tangakvakultur og den gennemsnitlige vinter SST for K1) og (2) 20 °C (den gennemsnitlige sommer SST for K4, og en hedebølge på 4 °C for K1). Alle glasglas, der blev brugt til overvågning af kelplivsfaseudvikling, blev markeret med et standardiseret gitter, og billeder i høj opløsning blev taget ved hjælp af dette gitter som reference for at muliggøre observation af faste felter gennem tiden ved hjælp af et omvendt mikroskop og kamera (N = 5 billeder pr. Prøve, 2.479 mm x 1.859 mm). Efter 24 d postsporulation blev gametofytter talt fra mikroskopbilleder (N = 300 billeder fra 60 prøver). For at teste for forskelle i gametofyttællinger blev generaliserede lineære blandede effektmodeller anvendt med Poisson-fordeling ved hjælp af funktionen glmmTMB () i pakke glmmTMB41, og parvise sammenligninger blev udført med emtrends () fra pakkemidler42i R. Vores resultater illustrerer, at gametofytternes respons på termisk variabilitet var forskellig mellem K1- og K4-populationer (t = 2,7, p = 0,007), hvor temperaturen ikke havde en effekt for den varmere K4-population (estimat = -0,01, standardfejl [SE] = 0,01, konfidensinterval [CI] = [-0,03, 0,01]), men havde en effekt for den køligere K1-population (estimat = -0,06, SE = 0,02, CI = [-0,10, -0,03]) (figur 6A), hvilket tyder på en mulig adaptiv divergens i termiske toleranceegenskaber. Kelp gametofytter er ofte afbildet som et resistensstadium43, hvilket betyder, at de producerer en fænotype til alle formål, der er stresstolerant og relativt ufølsom over for miljøvariabilitet. Disse resultater indikerer imidlertid, at termisk variabilitet pålægger et betydeligt tryk på dette tidlige stadium. Efter 32 d postsporulation blev synlige sporofytter med længder større end ca. 1 mm talt på hele hvert glasglas på 2,5 cm gange 7,5 cm (N = 72 prøver i alt). For at teste for forskelle i synlige sporofyttællinger blev generaliserede lineære blandede effektmodeller anvendt med Poisson-fordeling ved hjælp af funktionen glmmTMB () i pakke glmmTMB , og parvise sammenligninger blev udført med emtrends () fra pakkeemmeans i R. Vores resultater illustrerer, at sporofytternes respons på termisk variabilitet er ens mellem K1 og K4 differentierede populationer (z = 0,92, p = 0,36), hvor temperaturen havde en effekt for den varmere K4-population (estimat = -0,66, SE = 0,04, CI = [-0,74, – 0,57]), såvel som den køligere K1-population (estimat = -0,85, SE = 0,13, CI = [-1,10, -0,60]) (figur 6B). Prøverne opdrættet ved 20 °C viste kun få synlige sporofytter (gennemsnit ± SE = 0,4 ± 0,2) sammenlignet med prøver opdrættet ved 12 °C (gennemsnit ± SE = 82,4 ± 9,8). Dette resultat tyder på, at sporofytproduktion er mere temperaturfølsom end gametofytstadiet, og at stedspecifikke dyrkningstemperaturer ikke må overstige 15 °C for at opnå sporofytudvikling som beskrevet i protokollen. Figur 1: Diagram over inkubatorsystemet med »grønt grus« . A) Rød lyskilde til vegetativt fyldende gametofytkulturer. (B) Adgangsport til elektriske ledninger og slanger, der fører til en ekstern stikkontakt. (C) Struktur til blokering af fuldspektret lys ud af sektionen med rødt lys. D) En dyrkningsstrækning med »grønt grus« . E) fuldspektrede lyskilder. (F) Rørledninger, der er forbundet til en ekstern filtreret luftkilde. (G) Kontraventiler for at reducere luftbåren kontaminering. (H) Individuelle kulturbeholdere, der minimerer kontaminering. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Diagram over vandbadssystemet »grønt grus« . A) Køler med nedsænket pumpe (i I). (B) 20 gallon karbad til vandbad. C) Afløb for at recirkulere vandbad. D) Ventil til recirkulering af vandbad. (E) Lyskilde. F) 2,5 L beholder med grønt grus med gennemsigtigt låg og beluftningsåbning. G) Beluftningskilde. (H) Rør, der recirkulerer vand ved hjælp af nedsænkede pumper. I) Vandbadsmodtager fra/til køler fra/til kar med dykpumper. (J) Akryldæksel for at minimere fordampning af vandbad. (K) Mesh-skærm til justering af lysintensiteten. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Udvikling af Macrocystis pyrifera . Udviklingsmæssige livshistoriestadier af Macrocystis pyrifera fra laboratorievækstforsøg. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: »Grønt grus« podet med Macrocystis pyrifera. « Grønt grus ‘ podet med Macrocystis pyrifera dyrkes i laboratoriet, indtil sporofytter når 1-2 cm. ‘Grønt grus’ indsættes derefter og fortsætter med at vokse i marken. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Eksperimentelle tidsserier. Eksempelbilleder fra en tidsserie, der følger den eksperimentelle vækst og udvikling af Macrocystis pyrifera, gametofytter og sporofytter, der stammer fra to populationer indsamlet i Californien (USA) og dyrket ved to forskellige temperaturer. K1 = Santa Cruz, K4 = San Diego. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 6: Repræsentative resultater. Makrocystis pyrifera livsstadier observeret for K1 Santa Cruz San Diego K4 Santa Cruz oprindelsespopulationer dyrket ved konstante termiske forhold på 12 og 20 °C. Fejlbjælker, gennemsnit ± 1 SE. Stjerne (*) angiver statistisk signifikante forskelle (p < 0,05). (A) Gametofytter på dag 24 (N = 300 billeder i alt fra 60 prøver). (B) Synlige sporofytter på dag 32 (N = 72 prøver inden for et standardiseret område på 2,5 cm x 7,5 cm). Klik her for at se en større version af denne figur. Supplerende fil 1. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Antropogene klimaændringer er en voksende trussel mod verdenshavenes sundhed 44,45,46,47,48, hvilket resulterer i store forstyrrelser og tab af biodiversitet 49,50,51,52. For at fremskynde genopretningen af forringede økosystemer har De Forenede Nationer erklæret 2021 til 2030 for “FN’s årti for genopretning af økosystemer”, der falder sammen med “FN’s årti for havvidenskab for bæredygtig udvikling”, der sigter mod at vende forringelsen af havets sundhed⁵³. I overensstemmelse med denne globale opfordring til handling har Kelp Forest Alliance lanceret Kelp Forest Challenge for at genoprette 1 million hektar og beskytte 3 millioner hektar tangskov inden år^{2040 54}. Marine restaurering er undervurderet⁵⁵, og kelp økosystemer får betydeligt mindre opmærksomhed end levesteder som koralrev, mangrove skove og havgræs enge⁵⁶. Genopretning af forringede økosystemer har vist sig at være effektiv til genopbygning af marine økosystemer, men kan i gennemsnit koste mellem $ 80.000 – $ 1.600.000 pr. Hektar, med median samlede omkostninger sandsynligvis to til fire gange højere⁵⁷. Nuværende og forventede tab kræver udvikling af skalerbare, gennemførlige og omkostningseffektive kelprestaureringsmetoder som presserende bevaringsinterventioner.

Nuværende kelprestaureringsindsats bruger en kombination af metoder til at tackle stedspecifikke årsager til kelptab, herunder transplantation af voksne kelper, direkte såning af zoosporer og / eller gametofytter, græsningskontrol og installation af kunstige rev¹¹. Disse metoder kræver imidlertid betydelige ressourcer og har begrænset skalerbarhed. Typisk transplantation af voksne kelps kræver besværlig anvendelse af kunstige materialer eller strukturer på benthos, af dykkere. Bottom-up-interventioner for at genetablere kystnære stenrev, såsom kontrol af konkurrenter og græssere, er også begrænset af lønomkostninger, da de er afhængige af manuel fjernelse eller udelukkelse af disse biotiske stressorer¹¹. Teknikken “grønt grus” overvinder disse begrænsninger med enkel implementering fra overfladen, hvilket ikke kræver nogen undervandsinstallation eller teknisk viden og skalerbarhed til relativt lave omkostninger²⁸. Denne innovative tilgang giver et lovende restaureringsværktøj, der opfordrer til omfattende forsøg på tværs af forskellige steder og miljøer for at frigøre sit fulde potentiale³².

Mens vellykkede restaureringsbestræbelser med ‘grønt grus’ er blevet dokumenteret i beskyttede fjorde i Norge ved hjælp af sukkertangen, Saccharina latissima²⁶, er denne teknik stadig i pilotfasen for Macrocystis pyrifera i det østlige Stillehav. Yderligere forsøg er nødvendige for at imødegå det forventede overlevelse af M. pyrifera-udplanter inden for dets rækkevidde. Under bølgeeksponerede forhold, der er typiske for M. pyrifera-vækst , kan mindre grus være mere tilbøjeligt til bevægelse og slid, hvilket fører til beskadigede udplanter. Desuden kan positiv opdrift fra gasfyldte pneumatocyster af M. pyrifera føre til, at ‘grønne grus‘ udplanter effektivt transporteres væk fra restaureringsstedet, og grusstørrelse og vægt er derfor vigtige faktorer at undersøge for denne art. I en nylig pilotundersøgelse (maj 2022; Ensenada, Baja California, Mexico), er der observeret foreløbig succes i marken med M. pyrifera , indikeret ved haptera-binding til omgivende substrat og vækst af unge, der nåede 1,2 m i længden efter to måneder i marken (figur 4). Dette viser en klar mulighed, der endnu ikke er udforsket for at udnytte ‘grønt grus’ til M. pyrifera i det østlige Stillehav. Denne video viser teknikken ‘grøn grus’ med M. pyrifera og er en værdifuld ressource, der forenkler og centraliserer eksisterende praksis i dyrkningsfasen af restaurering for at understøtte undersøgelser, der adresserer succeser og begrænsninger i forskellige feltindstillinger.

Med ‘grøn grus‘ -teknikken kan mange mindre, individuelle grusenheder sås i en skala, der kan øge sandsynligheden for succes sammenlignet med mere almindelige transplantationsmetoder med voksne planter. Det vigtigste skalerbare aspekt af denne teknik er imidlertid dens enkle implementering fra overfladen, hvilket kan lette restaureringen af store områder med båd. For feltindstillinger, hvor implementering af lille grus ikke er egnet, kan denne protokol tilpasses til transplantation af M. pyrifera på en lang række underlag, herunder større grus eller endda små stenblokke, snor, der kan bindes til naturlige eller indsatte undervandsankre, eller fliser, der kan boltes eller limes ved hjælp af marine epoxy til havbunden under mere udsatte forhold. Disse implementeringstilpasninger vil ikke ændre de faciliteter, der er nødvendige for dyrkning af M. pyrifera , men vil efterfølgende øge omkostningerne ved implementering.

Antropogene forstyrrelser og klimaændringer er i øjeblikket ved at overvinde naturlige befolkningers evne til at tilpasse sig. Dette udgør betydelige udfordringer for traditionelle bevaringsbestræbelser, der genopretter økosystemer til deres historiske tilstande 58,59,60,61,62,63. Således er bevaringsrammerne udvidet til at omfatte foregribende forvaltning i betragtning af modstandsdygtighed og tilpasningsevne⁶⁴. Foregribende forvaltning for at imødegå klimaændringer implementeres for træarter i skovøkosystemer⁶⁵ og er blevet foreslået til yderligere genopretningsbestræbelser for at forbedre det evolutionære potentiale for udplantninger ^66,67. Selvom disse strategier i sagens natur er lettere at manipulere i jordbaserede miljøer, begynder flere undersøgelser at undersøge deres anvendelse i havmiljøer 62,68,69,70. For eksempel er koralrev truet af adskillige menneskeskabte stressfaktorer, der har resulteret i hidtil usete fald^71,72. Som reaktion på tabet af disse vigtige grundarter anbefales der i stigende grad aktiv restaurering og assisteret tilpasningsteknikker for at bevare de resterende koralrev og deres tilknyttede funktioner 62,73,74. En teknik involverer translokering af individer inden for deres nuværende artsudbredelsesområde for at øge tolerancen over for varmestress⁷⁵. Med hensyn til restaurering af baldakindannende kelper har ‘grøn grus’ en tilpasselig ramme til at udforske assisterede tilpasningsteknikker såsom translokation af modstandsdygtige genotyper til sårbare områder, ikke-genetisk manipulation såsom hybridisering eller akklimatisering af individer til miljøstress⁶² med resultater, der sigter mod at opnå mere resistente stammer til restaureringsprogrammer^76,77.

Udnyttelse af lokal støtte til at forbedre restaureringsbestræbelser er afgørende for at opretholde kelpøkosystembevaringssucces. Inddragelse af lokale interessenter kan øge den lokale opbakning til genopretningsbehov ^6,50 og fremme kystforvaltning, der efterfølgende kan resultere i øget finansiering og lang levetid for beskyttelse af kelpøkosystemer. Som med alle andre kelprestaureringsmetoder vil strukturerede beslutningsrammer, der integrerer forskellige økologiske, socioøkonomiske og bevaringsmål, hjælpe med at opnå optimale resultater for kelpøkosystemer og de samfund, de understøtter¹¹.

Materials

0.22 µm filters	Milipore	SCGPS05RE	Natural seawater sterilization
1 L glass bottles	Amazon	B07J6JP4D1	Natural seawater sterilization
1 µm filters (water + air)	Amazon	B01M1VWUWL	Natural seawater sterilization
1'' PVC 90-Degree Elbow	Home Depot	203812125	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
10 µm filters	Amazon	B00D04BG56	Natural seawater sterilization
20 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
3x5mm tubing	Amazon	B0852HXPN6	Option 1 Small scale – Incubator
4×4'' Sterile Gauze	Amazon	B07NDK8XM3	Sporulation
4x6mm tubing	Amazon	B08BCRV1FY	Option 1 Small scale – Incubator
5 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
50 mL falcon tubing	Amazon	B01M04HGPJ	Sporulation
8x10mm tubing	Amazon	B01MSM3LLZ	Option 1 Small scale – Incubator
Air filters	Thermo Fisher	MTGR85010	Option 1 Small scale – Incubator
Alcohol lamp	Amazon	B07XWD9WWC	Sporulation
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99%	Sigma	215406-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Aquarium Grade Gravel	Amazon	B07XRCKFBJ	Option 1 Small scale – Incubator
Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99%	Sigma	B4639-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g	Thermo Fisher	5090113707	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA	Thermo Fisher	P001225G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Check valves	Amazon	B08HRZR4MM	Option 1 Small scale – Incubator
Clear tubing 3/8'' – 10 ft	Amazon	B07MTYMW13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING – California – Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA	Thermo Fisher	5090114752	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Compound microscope with camera	OMAX	M83EZ-C50S	Monitoring
Culture flask	Thermo Fisher	07-250-080	Option 1 Small scale – Incubator
Culture light	Amazon	B07RRRPJ63	Option 1 Small scale – Incubator
Culture stoppers	Amazon	B07DX6J7QD	Option 1 Small scale – Incubator
Drainage connector	Amazon	B00GUZ6CV0	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2	Thermo Fisher	50213299	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL	Thermo Fisher	S81273	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL	Thermo Fisher	S81275	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets – Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye	Thermo Fisher	S81271	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Filter holder	Amazon	B07LCKBKCT	Natural seawater sterilization
Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA	Thermo Fisher	S63460	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
FLEXACAM C1 Camera	Leica	FLEXACAM C1	Monitoring
Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN	Thermo Fisher	AAJ6083314	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Free Standing 20 Gallon Utility Sink	Amazon	B094TLH19L	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR	Thermo Fisher	AC190000100	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA	Thermo Fisher	S88442	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass slides	Amazon	B00L1S93PS	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture	Sigma	G6501-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid	Container store	#10014828	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Growth light	Amazon	B086R14MFW	Option 1 Small scale – Incubator
Hemocytometer	Amazon	B07TJQDKLJ	Sporulation
HEPES 99.5% (titration)	Sigma	H3375-500G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Hinged plastic jars	SKS Bottle & Packaging	40280125.01S	Option 1 Small scale – Incubator
Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size – 100G Storage Conditions – +15 C TO +30 C Catalog Number – 26310.01 CAS 87-89-8	Thermo Fisher	50247745	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Instant Ocean – 50 G	Amazon	B000255NKA	Option 1 Small scale – Incubator
Inverted Microscope Leica DMi1	Leica	DMi1	Monitoring
Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97%	Sigma	236489-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Licor Ligth Meter Data Logger	Licor	LI-250A	Monitoring
Light/temperature HOBO data logger	Amazon	B075X2SWKN	Monitoring
Lights 150W	Amazon	B0799DQM9V	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications	Sigma	M8179-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds	Home Depot	206823930	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11,	Thermo Fisher	AAA1268330	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA	Thermo Fisher	ICN10256925	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
PCV cement	Amazon	B001D9WRWG	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B0006JLVE4	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B07G5FY7X1	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Precision scale 1mg	Amazon	B08DTH95FN	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Pump for filtered air	Amazon	B0BG2BT9RX	Option 1 Small scale – Incubator
PVC tubing 1×24''	Home Depot	202300505	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Quantum Light meter	Apogee Instruments	MQ-510	Monitoring
Refrigerated Incubator	Thermo Fisher	15-103-1566	Option 1 Small scale – Incubator
Rubber Grommets	Amazon	B07YZD22ZP	Option 1 Small scale – Incubator
Salinity refractometer	ATC	B018LRO1SU	Monitoring
Shade mesh 6×50 ft	Home depot	316308418	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA	Thermo Fisher	BP360500	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Soldering for aeration opening	Amazon	B08R3515SF	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Spray isporopyl alcohol	Amazon	‎ B08LW5P844	Sporulation
Stainless steel sissors	Amazon	B07BT4YLHT	Sporulation
Stainless steel tray	Amazon	B08CV33YXG	Sporulation
Stainless steel twizzers	Amazon	B01JTZTAJS	Sporulation
Stir Bars	Amazon	B07C4TNKXB	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Submersible circulation pump 400 GPH	Amazon	B07RZKRM13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Submersible Spherical Quantum Sensor	Waltz	US-SQS/L	Monitoring
Temperature gun	Infrared Thermometer 749	B07VTPJXH9	Monitoring
Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture	Sigma	T1270-25G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA	Thermo Fisher	AC157850250	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Transparent Acrylic sheet 24×48 inch	Home Depot	202038048	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Tubing water circulation 1''x10 ft	Amazon	B07ZC1PSF3	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
UV light for natural seawater sterilization	Amazon	B018OI7PYS	Natural seawater sterilization
Vacum pump	Amazon	B087XBTPVW	Natural seawater sterilization
Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98%	Sigma	V6629-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA	Thermo Fisher	S89446	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA	Thermo Fisher	S89445	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Water Chiller 200-600GPM	Amazon	B07BHHP71C	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Y-splitters for 4x6mm tubing	Amazon	B08XTJKFCH	Option 1 Small scale – Incubator
Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture	Sigma	Z0251-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment