Raccolta sul campo e manutenzione in laboratorio delle alghe giganti che formano la chioma per facilitare il ripristino

Summary

Questo protocollo descrive la raccolta sul campo e la regolare manutenzione in laboratorio di substrati seminati con alghe giganti che formano chiome per l’uso in prove di ripristino per affrontare il successo e i limiti della tecnica della “ghiaia verde” in ambienti di campo.

Abstract

Le alghe che formano la chioma sono specie di base essenziali, che supportano la biodiversità e forniscono servizi ecosistemici per un valore di oltre 500 miliardi di dollari all’anno. Il declino globale delle foreste di alghe giganti a causa di fattori di stress ecologici causati dal clima sottolinea la necessità di strategie di ripristino innovative. Una tecnica di ripristino emergente nota come “ghiaia verde” mira a seminare giovani alghe su vaste aree senza un ampio lavoro subacqueo e rappresenta uno strumento di ripristino promettente grazie all’economicità e alla scalabilità. Questo video illustra un protocollo e gli strumenti per la coltura di alghe giganti, Macrocystis pyrifera. Fornisce inoltre una risorsa per ulteriori studi per affrontare i successi e i limiti di questo metodo in contesti di campo. Descriviamo metodi sul campo e in laboratorio per la raccolta del tessuto riproduttivo, la sporulazione, l’inoculazione, l’allevamento, il mantenimento e il monitoraggio dei substrati seminati con le prime fasi di vita utilizzando la tecnica della “ghiaia verde”. Il protocollo semplifica e centralizza le attuali pratiche di ripristino in questo campo per supportare ricercatori, gestori e parti interessate nel raggiungimento degli obiettivi di conservazione delle alghe.

Introduction

Le alghe che formano la chioma (macroalghe brune dell’ordine Laminariales) sono specie di base importanti a livello globale, che dominano le scogliere rocciose costiere nei mari temperati e artici¹. Queste alghe formano habitat biogenici strutturalmente complessi e altamente produttivi, noti come foreste di alghe, che^{supportano comunità marine} tassonomicamente diversificate. Le foreste di alghe in tutto il mondo forniscono molti servizi ecosistemici all’uomo, tra cui la produzione di pesca commerciale, il ciclo del carbonio e dei nutrienti e le opportunità ricreative, con un valore totale stimato di 500 miliardi di dollari all’anno³.

Nonostante il loro valore considerevole, le foreste di alghe devono far fronte a crescenti pressioni antropogeniche in molte regioni³. Il cambiamento climatico rappresenta una delle minacce più significative per le alghe a causa del riscaldamento a lungo termine degli oceani combinato con la crescente frequenza delle anomalie di temperatura 3,4,5,6,7. L’aumento delle temperature oceaniche è associato alla limitazione dei nutrienti⁸, mentre l’esposizione a stress da calore al di sopra delle soglie fisiologiche può provocare mortalità⁹. In combinazione con fattori di stress locali regionali variabili⁷, le popolazioni di alghe stanno diminuendo a livello globale di circa il 2% all’anno¹⁰ con perdite significative e spostamenti persistenti verso stati comunitari alternativi in alcune regioni ^{6,11,12,13,14}. Il recupero naturale delle popolazioni di alghe da solo potrebbe non essere sufficiente a invertire l’entità delle perdite attuali e previste 15,16,17,18, sottolineando l’importanza di un ripristino attivo.

Gli attuali sforzi di ripristino delle alghe possono utilizzare una combinazione di metodologie per ristabilire queste importanti specie di base sulle scogliere rocciose costiere ^3,19. Le metodologie scelte per affrontare i problemi specifici del sito dipendono dal contesto geografico, dagli ostacoli specifici al recupero delle alghe e dal contesto socio-ecologico¹¹. Comprendere le connessioni e l’interdipendenza dei sistemi socio-ecologici è la chiave, e gli interventi che coinvolgono le istituzioni locali e ottengono il sostegno delle comunità locali aumentano la probabilità di successo degli sforzi di ripristino²⁰.

Oltre al cambiamento climatico, la pressione degli erbivori o la competizione interspecifica guidano, diminuiscono o sopprimono la ripresa (ad esempio, da parte dei ricci di mare¹³, dei pesci erbivori^21,22, delle alghe del tappeto erboso ^9,23 o delle alghe invasive²⁴). Il ripristino può concentrarsi sulla rimozione di questi fattori di stress biotici²⁵, sebbene questi metodi richiedano risorse sostanziali e una manutenzione continua¹¹. Per catalizzare il recupero delle specie di alghe, sono stati compiuti sforzi verso un approccio di semina diretta, ad esempio pesando sacchi a rete pieni di lame di alghe fertili al benthos che rilasciano zoospore^{nell’ambiente 26}. Questo metodo, tuttavia, richiede molto tempo e richiede l’installazione e la rimozione tecnica subacquea. Altri casi si concentrano sul trapianto di grandi quantità di piante intere adulte donatrici, che possono compromettere popolazioni di donatori strettamente associati e vulnerabili e sono spesso limitati a piccole dimensioni a causa della dipendenza dal trapianto continuo²⁷.

Per le regioni in cui la limitazione delle spore di alghe può ostacolare il recupero delle foreste di alghe a causa della frammentazione dell’habitat, è stato introdotto un approccio relativamente nuovo al ripristino delle alghe chiamato tecnica della “ghiaia verde”. La tecnica è stata sperimentata con successo presso la stazione di ricerca di Flødevigen, nel sud della Norvegia²⁸, e ha rappresentato un’opzione promettente per il restauro grazie all’economicità e alla scalabilità. Il flusso di lavoro di questa tecnica è il seguente: (1) una soluzione di spore viene creata da tessuto fertile raccolto da alghe adulte riproduttive sul campo e quindi seminato su piccoli substrati, come la ghiaia; (2) le alghe allo stadio iniziale sono allevate in condizioni abiotiche controllate in laboratorio su substrati; (3) I substrati con sporofiti visibili sono distribuiti sul campo su barriere coralline specifiche come “ghiaia verde”, dove gli sporofiti continuano a crescere. Si noti che i tipici sforzi di trapianto di individui adulti richiedono un’installazione subacquea laboriosa e inibitoria dal punto di vista dei costi da parte dei subacquei, e la tecnica della “ghiaia verde” utilizza un semplice dispiegamento dalla superficie²⁸.

La tecnica della “ghiaia verde” è attualmente in fase di sperimentazione da parte dei membri di numerosi gruppi di lavoro internazionali²⁹ in diversi ambienti e diverse specie di alghe laminariane. Questo protocollo descrive le strutture, i materiali e i metodi necessari per la raccolta dei tessuti, la sporulazione, la semina, le condizioni di allevamento, la manutenzione regolare e il monitoraggio delle alghe in fase iniziale prima di implementare questa tecnica di ripristino sul campo utilizzando l’alga gigante, Macrocystis pyrifera. Questo protocollo è una risorsa preziosa per ricercatori, manager e parti interessate che cercano di fornire informazioni sui successi e sui limiti di questo metodo con M. pyrifera in diversi contesti di campo.

Protocol

I tessuti di alghe utilizzati come descritto in questo protocollo sono stati raccolti e supervisionati dal California Department of Fish and Wildlife con il permesso S-202020004-20205-001. 1. Preparazione delle strutture e dei materiali Assicurarsi che gli impianti di coltura delle alghe siano in grado di mantenere la temperatura (10-15 °C), fornire luce a spettro completo (0-180 μmol fotoni m-2 s-1) e filtrare l’aerazione (dimensione dei pori di 0,2 μm). Utilizzare sistemi di incubazione con una presa incorporata o una porta di accesso per cavi e tubi, luci e una fonte d’aria (Figura 1). Se un sistema di incubazione non rientra nell’ambito, nel budget o nella scala prevista del progetto, utilizzare bagnomaria temperati da acqua di mare fredda e naturale o da un refrigeratore (Figura 2). Fare riferimento alla Tabella dei materiali per dettagli specifici.Posizionare un termometro nel terreno di coltura o utilizzare una pistola termica per assicurarsi che la temperatura sia compresa tra 10-18 °C.NOTA: Le temperature di allevamento sono specifiche del sito e della stagione30. Programmare le luci a spettro completo su un fotoperiodo di 12 ore di luce: 12 ore di buio modificando le impostazioni di temporizzazione sulla sorgente luminosa o utilizzando un timer meccanico. Misurare l’intensità della luce con un misuratore quantistico impermeabile a radiazione fotosinteticamente attiva (PAR) sotto la superficie vicino alla ghiaia e regolare utilizzando una sorgente luminosa dimmerabile o stratificando cellophane (nel caso di coltura vegetativa di gametofiti, vedere la Sezione 9) o una rete sulla sorgente luminosa (per i dettagli sulle regolazioni dell’intensità luminosa, vedere la Sezione 6.3). Garantire una corretta aerazione utilizzando pompe ad aria31 un giorno dopo la sporulazione. Utilizzare filtri (dimensione dei pori di 0,2 μm) per ridurre la contaminazione batterica presente nell’aria.NOTA: Per la coltura di “ghiaia verde”, la pressione di aerazione deve essere sufficiente per far circolare l’acqua in tutti i contenitori di coltura, senza disturbare l’attaccamento delle alghe in fase iniziale ai substrati seminati. Se è presente biomassa gametofita (vedere paragrafo 9.2), la pressione di aerazione deve essere sufficiente a mantenere i gametofiti sospesi nei terreni di coltura. Sterilizzare materiali e stazioni. Preparali in anticipo (vedi Tabella dei materiali).Pulire le superfici con alcol isopropilico al 70%. Maneggiare il tessuto riproduttivo e pulire le attrezzature per la raccolta al di fuori del vivaio di “ghiaia verde”, se possibile. Utilizzare i seguenti metodi di sterilizzazione: risciacquare con un detergente da laboratorio seguito da un accurato risciacquo con acqua distillata, immergere in una soluzione di candeggina diluita (secondo le indicazioni del produttore) seguita da un risciacquo accurato con acqua distillata e sterilizzare in autoclave utilizzando le impostazioni appropriate (vetreria o strumenti). Dopo la sterilizzazione, i materiali possono essere conservati in un contenitore sigillato o avvolti con un foglio. Strofinare e pulire i contenitori con i coperchi da utilizzare per la coltura utilizzando un detergente da laboratorio, seguito da un accurato risciacquo con acqua distillata.NOTA: I contenitori di coltura con coperchio aiutano a ridurre l’evaporazione dei terreni di crescita. Lasciare i coperchi leggermente aperti per consentire il ricambio d’aria o utilizzare una valvola di ritegno per ridurre la contaminazione nell’aria. Se non sono disponibili contenitori con coperchio, sigillare i contenitori di coltura con un materiale termoplastico come una pellicola di paraffina ed eseguire 2-3 perforazioni. Se si utilizzano serbatoi più grandi, utilizzare coperture antievaporazione in plastica trasparente. Assicurarsi che la ghiaia abbia una superficie strutturata o leggermente bucherellata poiché è più probabile che i gametofiti vengano trattenuti su substrati con un’elevata rugosità32,33. Strofinare e risciacquare la ghiaia fino a quando l’acqua non diventa limpida per rimuovere polvere o detriti. Immergere la ghiaia in una soluzione di candeggina diluita al 10% per almeno 24 ore e risciacquare con acqua di mare sterilizzata con filtro (vedere paragrafo 2.1). In alternativa, dopo aver strofinato e risciacquato, immergere la ghiaia per 1 settimana in acqua deionizzata (DI)32.NOTA: Idealmente, per ridurre la contaminazione del sito di restauro, viene utilizzato un substrato raccolto localmente. In alternativa, si consiglia di utilizzare ghiaia per acquari. Evitare substrati calcarei come il calcare, che possono portare allo sbiancamento dei tessuti e alla conseguente mortalità delle alghe trapiantate32. 2. Preparazione dei substrati di crescita Filtrare e sterilizzare l’acqua di mare secondo i seguenti metodi, a seconda della disponibilità delle risorse. Calcolare il volume di acqua di mare sterilizzata con filtro necessaria per rinfrescare i contenitori di coltura ogni settimana (vedere la Sezione 7) e programmare di conseguenza questa attività di filtrazione/sterilizzazione. Conservare grandi quantità di acqua di mare sterilizzata con filtro in contenitori bui per un massimo di 6 mesi a 8-10 °C. Se la refrigerazione non è disponibile, conservare in un luogo buio e fresco.Filtrare l’acqua utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto con una dimensione dei pori di 0,55-1 μm. Spegnere la fonte di vuoto prima che tutta l’acqua venga aspirata per evitare di danneggiare il filtro e versare l’acqua filtrata in un contenitore sterile dedicato. Per volumi maggiori, utilizzare un sistema di filtrazione a flusso continuo. Ad esempio, far passare l’acqua di mare attraverso una serie di tre filtri pieghettati (10 μm, 5 μm e 1 μm) disposti dalla dimensione dei pori più grande a quella più piccola.NOTA: Se l’acqua di mare naturale non è accessibile, è possibile preparare l’acqua di mare artificiale. In alternativa, l’acqua di mare naturale può essere acquistata nei negozi di acquari, sfusa ed è spesso filtrata, igienizzata e a pH bilanciato. L’arricchimento dei supporti è ancora necessario per queste opzioni. Sterilizzare l’acqua di mare filtrata utilizzando metodi UV e/o sterilizzazione in autoclave. Collegare i sistemi a flusso continuo a una luce UV dell’acquario a una portata consigliata dal produttore. Sterilizzare in autoclave l’acqua di mare in vetreria autoclave con coperchi leggermente aperti o coperti con pellicola e con un ciclo di liquidi (121°C; 1-2 PSI, 15-30 min a seconda del volume del liquido34.NOTA: Si consiglia di sterilizzare in autoclave l’acqua di mare filtrata per le prime fasi della coltura. L’arricchimento dell’acqua di mare sterilizzata con filtri con sostanze nutritive e vitamine è fondamentale per la crescita di M. pyrifera . Il terreno di coltura in acqua di mare arricchita (PES) Provasoli è un terreno ampiamente utilizzato progettato per le colture algali35. Acquista questo supporto dai centri di coltura algale. I preparati di PES e vitamine aggiuntive per la crescita di M. pyrifera sono descritti in34.Arricchire ogni 1 L di acqua di mare filtrata con 20 mL di PES. In alternativa, utilizzare terreni di coltura di livello industriale. Soluzioni di arricchimento del negozio secondo le raccomandazioni del produttore. Arricchire l’acqua di mare sterilizzata con filtro quando è necessario un mezzo di crescita per evitare la degradazione delle soluzioni di arricchimento. 3. Raccolta sul campo Determinare la tempistica delle raccolte di sporofilli per imitare il ciclo riproduttivo naturale delle popolazioni locali di M. pyrifera. Consultare esperti locali (ad esempio, ricercatori di alghe, manager, ecologi, cittadini scienziati, gruppi di immersione) per garantire una tempistica appropriata per la raccolta degli sporofilli. Ottenere i permessi necessari per la raccolta di tessuti di alghe che soddisfino le leggi e i regolamenti locali. Questa può essere una parte del processo di coltivazione che richiede molto tempo e deve essere incorporata nelle tempistiche del progetto. Con autorespiratore subacqueo (SCUBA) selezionare 3-5 lame di sporofillo da 10-15 individui fertili di M. pyrifera con sori visibili, distanziati di almeno 2 m l’uno dall’altro. Selezionare sporofilli puliti e intatti, se possibile, con poca o nessuna incrostazione o degradazione. Da questo momento in poi, conservare le lame dello sporofillo separatamente in base all’individuo genitore.NOTA: Gli sporofilli crescono in una densa “gonna” alla base, al di sopra della tenuta dell’alga adulta, e possono essere identificati dalla loro mancanza di pneumatocisti piene di gas1. Il tessuto sorus maturo è spesso leggermente sollevato e di colore più scuro rispetto al tessuto circostante1. Trasportare le lame degli sporofilli in sacchi di raccolta scuri per evitare la sovraesposizione alla luce solare, con una quantità minima di acqua di mare dal sito per mantenere le lame bagnate e conservare in refrigeratori a circa 12 °C fino all’arrivo nello spazio di coltura. Assicurarsi che i campioni non siano a diretto contatto con il ghiaccio.NOTA: Gli sporofilli possono essere spediti da o verso altre località.Sciacquare gli sporofilli con acqua di mare. Avvolgere le lame, raccolte da un singolo individuo di M. pyrifera , in carta assorbente umida imbevuta di acqua di mare e di nuovo in un foglio di alluminio per evitare la penetrazione della luce e l’ulteriore essiccazione36. Questo metodo di conservazione è comunemente noto come “metodo del burrito”. Metti questi pacchetti in una borsa frigo con ghiaccio, con una barriera protettiva come pluriball riciclato o cartone. Preparare il refrigeratore per la spedizione notturna. Assicurati che qualcuno sia disponibile a ricevere la spedizione e metti i pacchi in condizioni refrigerate. 4. Sporulazione Se possibile, trattare gli sporofilli in un ambiente a temperatura controllata tra 10-15 °C e lontano da qualsiasi altra coltura. Preparare e sterilizzare in anticipo gli strumenti e le stazioni. Indossare guanti protettivi quando si maneggia il tessuto di alghe per ridurre la contaminazione. Facoltativamente, conservare gli sporofilli per 12-48 ore in condizioni di refrigerazione, favorendo il rilascio di spore dal tessuto di sorus37. Per la conservazione, utilizzare il “metodo del burrito” descritto nella Sezione 3.3. Selezionare il tessuto maturo e tagliarlo in2 sezioni di 25 cm utilizzando forbici sterili. Selezionare 1-2 sezioni di sori pulite da 10-15 singoli genitori di alghe, per promuovere la diversità genetica.NOTA: Se conservato, facoltativamente, trovare segni di sporulazione parziale sui tovaglioli di carta, che indicano la presenza di tessuto fertile per il soro. Il tessuto del soro è spesso leggermente sollevato e di colore più scuro rispetto al tessuto circostante. Per pulire, strofinare delicatamente entrambi i lati del tessuto del soro in una sola direzione con una garza sterile inumidita con acqua di mare sterilizzata con filtro. Se necessario, raschiare delicatamente il tessuto del soro con una lama di rasoio sterile per rimuovere completamente le incrostazioni. Immergere la sezione sori in un bagno di acqua dolce per 30 secondi a 1 minuto e risciacquare con acqua di mare sterilizzata con filtro.NOTA: Rinfrescare il bagno d’acqua dolce e sterilizzare i materiali in uso quando si maneggiano diverse sezioni di sori da individui diversi per ridurre la contaminazione incrociata. Immergere ogni sezione di sori in acqua di mare sterilizzata con filtro temperata a 10-15 °C all’interno di una provetta da centrifuga sterile da 50 ml. Posizionare le provette a 4-12 °C al buio per sporulare per un massimo di 4 h. Se non è disponibile un frigorifero, conservarlo in un’area fresca e poco illuminata.NOTA: In alternativa, le sezioni sori possono essere sporulate in un unico contenitore sterile. Utilizzando un microscopio composto e un emocitometro, osservare la densità delle spore di 3-4 campioni ogni 30 minuti fino a 4 ore. Sostituire i puntali delle pipette tra un campione e l’altro. Se la densità è di almeno 10.000 spore mL-1 (vedere la Sezione 5.1.1), passare al passaggio successivo. Se una sezione di sori non produce spore dopo 4 ore, scartare il campione. Le spore possono depositarsi entro poche ore dal rilascio, ma possono essere osservate nuotare con un movimento circolare. Rimuovere ogni sezione di sori dalle provette con una pinzetta sterile. Combina le soluzioni di spore risultanti in un unico contenitore sterilizzato e quantifica la densità combinata finale. 5. Inoculazione Calcolare il volume finale di soluzione di spore necessario per l’inoculazione. Assicurarsi che la concentrazione finale sia di circa 500-1.000 spore mL−1 nei contenitori di coltura.Per calcolare la concentrazione del campione di spore combinato dai conteggi della griglia centrale dell’emocitometro, dividere il conteggio per 10-4 mL (che rappresenta il volume di soluzione visualizzato nell’emocitometro). Per determinare il volume della soluzione di spore da aggiungere a ciascun contenitore, determinare la quantità di terreno di coltura necessario per immergere i substrati all’interno dei contenitori di coltura. Per trovare il numero totale di spore in ogni contenitore, moltiplicare questo volume di acqua di mare per la concentrazione desiderata. Per determinare il volume totale della soluzione di spore da aggiungere, dividere la quantità totale di spore per la concentrazione di spore per mL nella soluzione di spore. Posizionare vetrini di vetro sterili all’interno di contenitori di coltura per monitorare lo sviluppo di alghe. Includere almeno 30 vetrini distribuiti in modo casuale tra i contenitori di coltura per un monitoraggio sufficiente (vedere i dettagli nella Sezione 7). Inoculare il volume calcolato di soluzione di spore nel contenitore di coltura utilizzando un puntale per pipetta sterile contenente substrati immersi in terreni di crescita. Chiudere il contenitore e mescolare delicatamente per distribuire le spore. Sigillare e posizionare il contenitore nel sistema di coltura. 6. Condizioni di allevamento Impostare la temperatura tra 10-15 °C in base alla temperatura del sito di distribuzione. Dopo 1 giorno, fornire una leggera aerazione con una fonte d’aria filtrata. Impostare le luci LED a spettro completo per piante acquatiche su una luce di 12 ore: ciclo di buio di 12 ore, con intensità luminose comprese tra 0-180 μmol fotone m-2 s-1:Impostare l’intensità della luce a 5-10 μmol di fotone m-2 s-1 da 0-1 giorno e aumentare a 20 – 30 μmol di fotone m-2 s-1 entro la fine di 1 settimana. Da questo punto in poi, aumentare l’irraggiamento di 10-20 μmol di fotone m-2 s-1 ogni 3-4 giorni fino a raggiungere un irraggiamento di 180 μmol di fotone m-2 s-1 alla fine di 6 settimane. Continuare ad allevare colture a 180 μmol di fotone m-2 s-1 fino alla fine di 8 settimane, o quando gli sporofiti hanno raggiunto circa 1-2 cm di lunghezza. 7. Monitoraggio Monitorare almeno due vetrini casuali al giorno/a giorni alterni per le prime due settimane per valutare lo sviluppo.Per monitorare, maneggiare il vetrino con una pinzetta sterilizzata e metterlo in una capsula di Petri pulita contenente abbastanza acqua di mare sterilizzata per immergere il vetrino. Non restituire i vetrini alle colture dopo essere stati rimossi per evitare la contaminazione incrociata. Utilizzare un microscopio composto o invertito con un ingrandimento di 40-400x per osservare le alghe in fase iniziale. Tenere traccia dello sviluppo con la seguente sequenza temporale (vedere la Figura 3 per esempi di fasi della storia della vita dello sviluppo).NOTA: Le spore sedimentate si osservano a 0-1 d. Le spore possono germinare nel giro di poche ore, come dimostrato dalla formazione di un tubo germinale. La germinazione si osserva tipicamente a 1-2 giorni. I primi gametofiti si osservano tipicamente a 1-4 giorni. La gametogenesi, il processo mediante il quale le cellule subiscono la divisione e la differenziazione per formare gameti maschili e femminili, si osserva in genere entro le prime due settimane. Le cellule femminili sono 5-7 volte più grandi di quelle maschili. I gametofiti maschi sviluppano rami sottili e filamentosi, mentre le femmine sono di forma più rotonda o ovoidale. Le femmine in genere producono uova o ovuli entro 2-3 settimane. Lo sperma rilasciato dai maschi nuota verso le femmine e feconda le uova, con conseguente formazione di zigoti diploidi. Avere la giusta densità di inoculo garantirà il successo della riproduzione per prossimità38,39. Gli ovuli fecondati si sviluppano in sporofiti embrionali. Gli sporofiti si osservano in genere entro 2-4 settimane. Lo zigote subisce una rapida divisione cellulare, con conseguente crescita di lame di 1-2 cm entro circa 6-8 settimane. Dopo due settimane, monitorare almeno due vetrini casuali 1-2 volte alla settimana per una crescita sana e la contaminazione fino a quando gli sporofiti non raggiungono una dimensione di 1-2 cm.NOTA: Una crescita sana è caratterizzata da una colorazione bruno-dorata (al contrario del verde o trasparente). Ci sono diverse metriche quantitative che possono essere osservate sui vetrini con un microscopio invertito, tra cui la sopravvivenza, il tasso di germinazione, lo sviluppo vegetativo, la maturità riproduttiva e la fecondità e il rapporto tra i sessi40. Valuta la contaminazione da batteri, funghi, ciliati e diatomee con un microscopio. Rimuovere la contaminazione isolata. Controllare i segni precoci di contaminazione da diatomee con il trattamento con biossido di germanio (GeO2 ) (vedere paragrafo 8.3). 8. Manutenzione Regolare le condizioni di luce secondo la Sezione 6.3. Ogni settimana, cambia il terreno di coltura per reintegrare i nutrienti e i minerali necessari per la crescita di M. pyrifera .Raffreddare il substrato di crescita fresco alla temperatura appropriata. Assicurarsi che la temperatura non superi i 15 °C durante questo processo. Aspirare i substrati dai contenitori di coltura per evitare di disturbare i substrati seminati. Lasciare scolare il terreno fino a quando il contenitore non è quasi vuoto. Aggiornare immediatamente i supporti per ridurre al minimo l’essiccazione. Quando si riempiono i contenitori di crescita, inclinarli leggermente in modo che il terreno scorra lungo il lato del contenitore di coltura per disturbare il minimo i substrati. Riorganizzare in modo casuale le posizioni del contenitore o della vasca durante i cambi settimanali dei supporti per tenere conto delle differenze nell’irradiazione della luce.NOTA: Vedere il file supplementare 1 per un calendario per tenere traccia delle attività e delle aspettative per le colture di Macrocystis. Indica i tempi di regolazione della luce e dell’aerazione, nonché i cambi settimanali dei supporti. Facoltativamente, controllare la contaminazione da diatomee con un trattamento a base di biossido di germanio (GeO2 ). Aggiungere 0,3-0,5 mL di 250 mg/mL di GeO2 a ogni 1 L di acqua di mare aggiunta ai substrati seminati per ridurre la contaminazione diffusa delle diatomee.NOTA: GeO2 può inibire la produzione di gameti algali. Applicare un trattamento con GeO2 nella breve finestra dopo la germinazione e prima dei picchi di produzione di ovuli e spermatozoi (1-7 giorni) e/o dopo la fecondazione degli ovuli e le osservazioni degli sporofiti (>21 giorni), seguito da un cambio di terreno 48 ore dopo per rimuovere la sostanza chimica. Queste tempistiche possono variare in base alle condizioni di coltura, quindi il monitoraggio dello sviluppo della fase di vita con la microscopia è il modo migliore per valutare i tempi di applicazione di GeO2 . Se la contaminazione da diatomee persiste nei contenitori di coltura e si osserva una crescita eccessiva sulle alghe in fase iniziale, prendere in considerazione la possibilità di riseminare i substrati. 9. Coltivazione di gametofiti vegetativi di alghe giganti Propagare le colture di gametofiti in condizioni vegetative tutto l’anno per ridurre la dipendenza dalla raccolta stagionale di sporofilli dalla barriera corallina naturale.Conservare le colture di gametofiti in base alla popolazione di origine in matracci riempiti con terreni di crescita a 4-12 °C in luce rossa ad un’intensità di 5-20 μmol fotone m-2 s-1 in un ciclo di buio 12 luce: 12. Fornire un’aerazione costante e cambiare i mezzi ogni 2-6 mesi. Per aumentare la biomassa dei gametofiti che sono cresciuti asessualmente per l’uso nella semina di “ghiaia verde”, aumentare l’aerazione per sospendere i gametofiti, aumentare la frequenza dei cambiamenti di terreno a settimanali e frammentare i gametofiti ogni due settimane.Sospendere la biomassa gametofita nel pallone di coltura agitando o agitando e raschiare i lati del pallone di coltura con uno strumento sterile per rimuovere i gametofiti attaccati, se necessario. Versare i gametofiti sospesi in un frullatore sterile o in un macinacaffè e pulsare la soluzione di gametofito per 1-2 s circa 5-15 volte, a seconda della concentrazione di biomassa, fino a quando non sono visibili masse raggruppate. Per indurre la riproduzione per la semina di “ghiaia verde”, frammentare i gametofiti, come spiegato sopra. Quindi, inoculare il substrato e aumentare la luce LED a spettro completo da 5-20 a 45-60 μmol fotone m-2 s-1 (+10 μmol fotone m-2 s-1 al giorno per la fotoacclimatazione), quindi aumentare di 10-20 μmol fotone m-2 s-1 ogni 3-4 d fino a raggiungere un irraggiamento di 180 μmol fotone m-2 s-1. 10. Distribuzione Dopo 6-8 settimane di coltura in laboratorio, assicurarsi che gli sporofiti giovani siano lunghi 1-2 cm e pronti per la distribuzione (Figura 4). Aggiornare i terreni di coltura nei contenitori di coltura 24 ore prima della distribuzione. Ottenere i permessi necessari per la distribuzione della ghiaia che soddisfino le leggi e i regolamenti locali. Questa può essere una parte del processo di coltivazione che richiede molto tempo e deve essere incorporata nelle tempistiche del progetto. Trasporta la “ghiaia verde” in vassoi coperti con asciugamani imbevuti di acqua di mare per mantenere le alghe idratate. Posizionare i vassoi in refrigeratori isolati con ghiaccio, assicurandosi che non siano a diretto contatto con il ghiaccio. Assicurarsi che la “ghiaia verde” sia ben imballata per evitare il rotolamento dei substrati e il distacco degli sporofiti durante il trasporto.NOTA: A seconda della disponibilità di spazio, i substrati possono anche essere trasportati nei loro contenitori di coltura o vasche per ridurre la manipolazione. Trasporta la “ghiaia verde” per un massimo di 6 ore in una cella frigorifera ombreggiata. Il dispiegamento deve essere programmato per evitare la luce solare più diretta. Se si dispiega da una barca, utilizzare una struttura ombreggiata per evitare il sole diretto durante il processo di schieramento. Spargere con cura la “ghiaia verde” dalla superficie sulla barriera corallina sottostante o tramite SCUBA quando si effettuano prove in nuovi siti e su piccola scala.

Representative Results

La tecnica di ripristino della “ghiaia verde” è ancora in fase pilota, con dati limitati sulla sopravvivenza all’espianto per altre specie28 e dati ancora pubblicati per Macrocystis pyrifera. Utilizzando la raccolta sul campo e la manutenzione in laboratorio delineata in questo protocollo, abbiamo testato il significato delle condizioni di allevamento specifiche del sito per due distinte popolazioni di alghe donatrici prima di un’ipotetica distribuzione di “ghiaia verde” (Figura 5). Il tessuto di alghe riproduttive è stato raccolto in California (USA) da popolazioni K1 più fredde (Santa Cruz 36.60167°N, 121.88508°W) e K4 più calde (San Diego, 32.85036°N, -117.27600°W) e allevato a due temperature: (1) 12 °C (la temperatura di coltura standard per l’acquacoltura di alghe marine e la SST invernale media per K1) e (2) 20 °C (la SST media estiva per K4, e un’ondata di caldo di 4 °C per il K1). Tutti i vetrini utilizzati per monitorare lo sviluppo dello stadio di vita delle alghe sono stati contrassegnati con una griglia standardizzata e le immagini ad alta risoluzione sono state catturate utilizzando questa griglia come riferimento per consentire l’osservazione di campi fissi nel tempo utilizzando un microscopio invertito e una fotocamera (N = 5 immagini per campione, 2,479 mm x 1,859 mm). Dopo 24 giorni dalla sporulazione, i gametofiti sono stati contati dalle immagini al microscopio (N = 300 immagini da 60 campioni). Per testare le differenze nella conta dei gametofiti, sono stati impiegati modelli lineari generalizzati di effetti misti con distribuzione di Poisson utilizzando la funzione glmmTMB() nel pacchetto glmmTMB41, e sono stati condotti confronti a coppie con emtrends() dal pacchetto emmeans42in R. I nostri risultati illustrano che la risposta dei gametofiti alla variabilità termica è stata diversa tra le popolazioni K1 e K4 (t = 2,7, p = 0,007), dove la temperatura non ha avuto un effetto per la popolazione K4 più calda (stima = -0,01, errore standard [SE] = 0,01, intervallo di confidenza [CI] = [-0,03, 0,01]), ma ha avuto un effetto per la popolazione K1 più fredda (stima = -0,06, SE = 0,02, CI = [-0,10, -0,03]) (Figura 6A), suggerendo una possibile divergenza adattativa nei tratti di tolleranza termica. I gametofiti delle alghe sono spesso raffigurati come uno stadiodi resistenza 43, il che significa che producono un fenotipo per tutti gli usi che è tollerante allo stress e relativamente insensibile alla variabilità ambientale. Tuttavia, questi risultati indicano che la variabilità termica impone una pressione significativa in questa fase iniziale. Dopo 32 giorni di sporulazione, gli sporofiti visibili con lunghezza superiore a circa 1 mm sono stati contati sulla totalità di ciascun vetrino di 2,5 cm per 7,5 cm (N = 72 campioni totali). Per testare le differenze nella conta degli sporofiti visibili, sono stati impiegati modelli lineari generalizzati ad effetti misti con distribuzione di Poisson utilizzando la funzione glmmTMB() nel pacchetto glmmTMB e sono stati condotti confronti a coppie con emtrends() dalle medi del pacchetto in R. I nostri risultati illustrano che la risposta degli sporofiti alla variabilità termica è simile tra le popolazioni differenziate K1 e K4 (z = 0,92, p = 0,36), dove la temperatura ha avuto un effetto per la popolazione K4 più calda (stima = -0,66, SE = 0,04, CI = [-0,74, – 0,57]), così come la popolazione K1 più fredda (stima = -0,85, SE = 0,13, CI = [-1,10, -0,60]) (Figura 6B). I campioni allevati a 20 °C hanno sviluppato pochi sporofiti visibili (media ± SE = 0,4 ± 0,2) rispetto a quelli allevati a 12 °C (media ± SE = 82,4 ± 9,8). Questo risultato suggerisce che la produzione di sporofiti è più sensibile alla temperatura rispetto allo stadio di gametofito e che le temperature di coltura sito-specifiche non devono superare i 15 °C per ottenere lo sviluppo dello sporofito come delineato nel protocollo. Figura 1: Schema del sistema di incubazione a “ghiaia verde”. (A) Sorgente di luce rossa per colture di gametofito vegetativamente bulking. (B) Porta di accesso per cavi elettrici e tubi, che conduce a una presa esterna. (C) Struttura per bloccare la luce a spettro completo dalla sezione a luce rossa. (D) Una sezione di coltivazione di «ghiaia verde». (E) sorgenti luminose a spettro completo. (F) Tubi collegati a una fonte esterna di aria filtrata. (G) Valvole di ritegno per ridurre la contaminazione aerodispersa. (H) Contenitori di coltura individuali che riducono al minimo la contaminazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Schema del sistema a bagno d’acqua a «ghiaia verde» . (A) Refrigeratore con pompa sommersa (in I). (B) Vasca da 20 galloni per bagnomaria. (C) Scaricare per far ricircolare il bagnomaria. (D) Valvola per il ricircolo del bagnomaria. (E) Sorgente luminosa. (F) Contenitore da 2,5 L in “ghiaia verde” con coperchio trasparente e apertura di aerazione. (G) Sorgente di aerazione. (H) Tubi che fanno ricircolare l’acqua con l’uso di pompe sommerse. (I) Ricevitore bagno d’acqua da/per refrigeratore da/per vasche con pompe sommergibili. (J) Copertura in acrilico per ridurre al minimo l’evaporazione del bagnomaria. (K) Paralume a rete per regolare l’intensità della luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Sviluppo di Macrocystis pyrifera . Fasi della storia di vita dello sviluppo di Macrocystis pyrifera da prove di crescita in laboratorio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: «Ghiaia verde» seminata con Macrocystis pyrifera. La ghiaia verde seminata con Macrocystis pyrifera viene coltivata in laboratorio fino a quando gli sporofiti raggiungono 1-2 cm. La “ghiaia verde” viene quindi distribuita e continua a crescere nel campo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Serie temporali sperimentali. Immagini di esempio tratte da una serie storica che segue la crescita e lo sviluppo sperimentale di gametofiti e sporofiti di Macrocystis pyrifera provenienti da due popolazioni raccolte in California (USA) e coltivate a due diverse temperature. K1 = Santa Cruz, K4 = San Diego. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Risultati rappresentativi. Stadi di vita di Macrocystis pyrifera osservati per le popolazioni di origine K1 Santa Cruz, San Diego, K4 Santa Cruz, coltivate a condizioni termiche costanti di 12 e 20 °C. Barre di errore, media ± 1 SE. L’asterisco (*) indica differenze statisticamente significative (p < 0,05). (A) Gametofiti al giorno 24 (N = 300 immagini totali da 60 campioni). (B) Sporofiti visibili al giorno 32 (N = 72 campioni, all’interno di un’area standardizzata di 2,5 cm per 7,5 cm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Fascicolo supplementare 1. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

Il cambiamento climatico antropogenico è una minaccia crescente per la salute degli oceani del mondo 44,45,46,47,48, con conseguenti gravi perturbazioni e perdita di biodiversità 49,50,51,52. Per accelerare il ripristino degli ecosistemi degradati, le Nazioni Unite hanno dichiarato il 2021-2030 il “Decennio delle Nazioni Unite per il ripristino degli ecosistemi”, in coincidenza con il “Decennio delle scienze oceaniche delle Nazioni Unite per lo sviluppo sostenibile”, che mira a invertire il deterioramento della salute degli oceani⁵³. In linea con questo invito globale all’azione, la Kelp Forest Alliance ha lanciato la Kelp Forest Challenge per ripristinare 1 milione di ettari e proteggere 3 milioni di ettari di foresta di alghe entro il 2040⁵⁴. Il ripristino marino è sottovalutato⁵⁵ e gli ecosistemi di alghe ricevono molta meno attenzione rispetto ad habitat come le barriere coralline, le foreste di mangrovie e le praterie di fanerogame marine⁵⁶. Il ripristino degli ecosistemi degradati ha dimostrato di essere efficace nella ricostruzione degli ecosistemi marini, ma può costare in media tra gli 80.000 e i 1.600.000 dollari per ettaro, con costi totali mediani che potrebbero essere da due a quattro volte superiori⁽⁵⁷). Le perdite attuali e previste richiedono lo sviluppo di metodologie di ripristino delle alghe scalabili, fattibili ed economiche come interventi urgenti di conservazione.

Gli attuali sforzi di ripristino delle alghe utilizzano una combinazione di metodologie per affrontare i fattori specifici della perdita di alghe, tra cui il trapianto di alghe adulte, la semina diretta di zoospore e/o gametofiti, il controllo dei pascolatori e l’installazione di barriere artificiali¹¹. Tuttavia, questi metodi richiedono risorse sostanziali e hanno una scalabilità limitata. Il tipico trapianto di alghe adulte richiede il laborioso dispiegamento di materiali o strutture artificiali sul benthos, da parte dei subacquei. Anche gli interventi dal basso verso l’alto per ristabilire le barriere coralline rocciose costiere, come il controllo dei concorrenti e dei pascolatori, sono limitati dai costi di manodopera in quanto si basano sulla rimozione manuale sott’acqua o sull’esclusione di questi fattori di stress biotici¹¹. La tecnica della “ghiaia verde” supera questi limiti con un semplice dispiegamento dalla superficie, che non richiede installazioni subacquee o conoscenze tecniche e scalabilità a costi relativamente bassi²⁸. Questo approccio innovativo fornisce uno strumento di restauro promettente, sollecitando prove approfondite in luoghi e ambienti diversi per sbloccare il suo pieno potenziale³².

Mentre sono stati documentati sforzi di ripristino di successo con la “ghiaia verde” nei fiordi riparati in Norvegia utilizzando l’alga da zucchero, Saccharina latissima²⁶, questa tecnica è ancora in fase pilota per Macrocystis pyrifera nel Pacifico orientale. Sono necessari ulteriori studi per affrontare la sopravvivenza prevista degli espianti di M. pyrifera all’interno del suo areale. Nelle condizioni di esposizione alle onde, tipiche della crescita di M. pyrifera , la ghiaia più piccola può essere più soggetta a movimenti e abrasioni, portando a esemplari danneggiati. Inoltre, la galleggiabilità positiva fornita dalle pneumatocisti piene di gas di M. pyrifera può portare a espianti di “ghiaia verde” che vengono effettivamente portati via dal sito di ripristino e, quindi, le dimensioni e il peso della ghiaia sono fattori importanti da esplorare per questa specie. In un recente studio pilota (maggio 2022; Ensenada, Baja California, Messico), è stato osservato un successo preliminare sul campo con M. pyrifera , indicato dall’attaccamento degli apteri al substrato circostante e dalla crescita dei giovani che raggiungono 1,2 m di lunghezza dopo due mesi sul campo (Figura 4). Ciò dimostra una chiara opportunità che deve ancora essere esplorata nell’utilizzo della “ghiaia verde” per M. pyrifera nel Pacifico orientale. Questo video mostra la tecnica della “ghiaia verde” con M. pyrifera ed è una risorsa preziosa che semplifica e centralizza le pratiche esistenti nella fase di coltura del restauro per supportare gli studi che affrontano i successi e i limiti in diversi contesti di campo.

Con la tecnica della “ghiaia verde“, molte singole unità di ghiaia più piccole possono essere seminate su una scala che può aumentare la probabilità di successo rispetto agli approcci di trapianto più comuni con piante adulte. Tuttavia, l’aspetto scalabile chiave di questa tecnica è il suo semplice dispiegamento dalla superficie, che può facilitare il ripristino di grandi aree in barca. Per gli ambienti di campo in cui l’impiego di ghiaia di piccole dimensioni non è adatto, questo protocollo può essere adattato per trapiantare M. pyrifera su un’ampia gamma di substrati, tra cui ghiaia più grande o anche piccoli massi, corde che possono essere legate ad ancoraggi subacquei naturali o dispiegati, o piastrelle che possono essere imbullonate o incollate con resina epossidica marina sul fondo del mare in condizioni più esposte. Questi adattamenti non modificheranno le strutture necessarie per la coltura di M. pyrifera , ma aumenteranno successivamente i costi di diffusione.

Le perturbazioni antropiche e i cambiamenti climatici stanno attualmente mettendo a dura prova la capacità di adattamento delle popolazioni naturali. Ciò pone sfide significative agli sforzi di conservazione tradizionali che riportano gli ecosistemi ai loro stati storici 58,59,60,61,62,63. Pertanto, i quadri di conservazione si sono ampliati per includere la gestione anticipatoria che tiene conto della resilienza e della capacità di adattamento⁶⁴. La gestione preventiva per affrontare i cambiamenti climatici è in corso di attuazione per le specie arboree negli ecosistemi forestali⁶⁵ ed è stata proposta per ulteriori sforzi di ripristino volti a migliorare il potenziale evolutivo degli espianti ^66,67. Sebbene queste strategie siano intrinsecamente più facili da manipolare in ambienti terrestri, diversi studi stanno iniziando a esplorare la loro applicazione in ambienti marini 62,68,69,70. Ad esempio, le barriere coralline sono minacciate da numerosi fattori di stress antropogenici che hanno provocato un declino senza precedenti^71,72. In risposta alla perdita di queste importanti specie di base, il ripristino attivo e le tecniche di adattamento assistito sono sempre più raccomandate per conservare le barriere coralline rimanenti e le loro funzioni associate 62,73,74. Una tecnica prevede la traslocazione degli individui all’interno del loro attuale areale di distribuzione delle specie per aumentare la tolleranza allo stress da calore⁷⁵. Per quanto riguarda il ripristino delle alghe che formano la chioma, la “ghiaia verde” ha un quadro personalizzabile per esplorare tecniche di adattamento assistito come la traslocazione di genotipi resilienti in aree vulnerabili, la manipolazione non genetica come l’ibridazione o l’acclimatazione degli individui allo stress ambientale⁶² con risultati volti a ottenere ceppi più resistenti per i programmi di ripristino^76,77.

Sfruttare il sostegno locale per migliorare gli sforzi di ripristino è fondamentale per sostenere il successo della conservazione dell’ecosistema delle alghe. Il coinvolgimento delle parti interessate locali può aumentare l’adesione locale alle esigenze di ripristino ^6,50 e promuovere la gestione delle coste che potrebbe successivamente tradursi in un aumento dei finanziamenti e della longevità della protezione dell’ecosistema delle alghe. Come per tutte le altre metodologie di ripristino delle alghe, quadri decisionali strutturati che integrano diversi obiettivi ecologici, socioeconomici e di conservazione contribuiranno a raggiungere risultati ottimali per gli ecosistemi di alghe e le comunità che sostengono¹¹.

Materials

0.22 µm filters	Milipore	SCGPS05RE	Natural seawater sterilization
1 L glass bottles	Amazon	B07J6JP4D1	Natural seawater sterilization
1 µm filters (water + air)	Amazon	B01M1VWUWL	Natural seawater sterilization
1'' PVC 90-Degree Elbow	Home Depot	203812125	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
10 µm filters	Amazon	B00D04BG56	Natural seawater sterilization
20 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
3x5mm tubing	Amazon	B0852HXPN6	Option 1 Small scale – Incubator
4×4'' Sterile Gauze	Amazon	B07NDK8XM3	Sporulation
4x6mm tubing	Amazon	B08BCRV1FY	Option 1 Small scale – Incubator
5 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
50 mL falcon tubing	Amazon	B01M04HGPJ	Sporulation
8x10mm tubing	Amazon	B01MSM3LLZ	Option 1 Small scale – Incubator
Air filters	Thermo Fisher	MTGR85010	Option 1 Small scale – Incubator
Alcohol lamp	Amazon	B07XWD9WWC	Sporulation
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99%	Sigma	215406-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Aquarium Grade Gravel	Amazon	B07XRCKFBJ	Option 1 Small scale – Incubator
Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99%	Sigma	B4639-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g	Thermo Fisher	5090113707	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA	Thermo Fisher	P001225G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Check valves	Amazon	B08HRZR4MM	Option 1 Small scale – Incubator
Clear tubing 3/8'' – 10 ft	Amazon	B07MTYMW13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING – California – Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA	Thermo Fisher	5090114752	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Compound microscope with camera	OMAX	M83EZ-C50S	Monitoring
Culture flask	Thermo Fisher	07-250-080	Option 1 Small scale – Incubator
Culture light	Amazon	B07RRRPJ63	Option 1 Small scale – Incubator
Culture stoppers	Amazon	B07DX6J7QD	Option 1 Small scale – Incubator
Drainage connector	Amazon	B00GUZ6CV0	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2	Thermo Fisher	50213299	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL	Thermo Fisher	S81273	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL	Thermo Fisher	S81275	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets – Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye	Thermo Fisher	S81271	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Filter holder	Amazon	B07LCKBKCT	Natural seawater sterilization
Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA	Thermo Fisher	S63460	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
FLEXACAM C1 Camera	Leica	FLEXACAM C1	Monitoring
Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN	Thermo Fisher	AAJ6083314	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Free Standing 20 Gallon Utility Sink	Amazon	B094TLH19L	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR	Thermo Fisher	AC190000100	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA	Thermo Fisher	S88442	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass slides	Amazon	B00L1S93PS	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture	Sigma	G6501-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid	Container store	#10014828	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Growth light	Amazon	B086R14MFW	Option 1 Small scale – Incubator
Hemocytometer	Amazon	B07TJQDKLJ	Sporulation
HEPES 99.5% (titration)	Sigma	H3375-500G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Hinged plastic jars	SKS Bottle & Packaging	40280125.01S	Option 1 Small scale – Incubator
Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size – 100G Storage Conditions – +15 C TO +30 C Catalog Number – 26310.01 CAS 87-89-8	Thermo Fisher	50247745	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Instant Ocean – 50 G	Amazon	B000255NKA	Option 1 Small scale – Incubator
Inverted Microscope Leica DMi1	Leica	DMi1	Monitoring
Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97%	Sigma	236489-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Licor Ligth Meter Data Logger	Licor	LI-250A	Monitoring
Light/temperature HOBO data logger	Amazon	B075X2SWKN	Monitoring
Lights 150W	Amazon	B0799DQM9V	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications	Sigma	M8179-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds	Home Depot	206823930	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11,	Thermo Fisher	AAA1268330	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA	Thermo Fisher	ICN10256925	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
PCV cement	Amazon	B001D9WRWG	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B0006JLVE4	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B07G5FY7X1	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Precision scale 1mg	Amazon	B08DTH95FN	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Pump for filtered air	Amazon	B0BG2BT9RX	Option 1 Small scale – Incubator
PVC tubing 1×24''	Home Depot	202300505	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Quantum Light meter	Apogee Instruments	MQ-510	Monitoring
Refrigerated Incubator	Thermo Fisher	15-103-1566	Option 1 Small scale – Incubator
Rubber Grommets	Amazon	B07YZD22ZP	Option 1 Small scale – Incubator
Salinity refractometer	ATC	B018LRO1SU	Monitoring
Shade mesh 6×50 ft	Home depot	316308418	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA	Thermo Fisher	BP360500	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Soldering for aeration opening	Amazon	B08R3515SF	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Spray isporopyl alcohol	Amazon	‎ B08LW5P844	Sporulation
Stainless steel sissors	Amazon	B07BT4YLHT	Sporulation
Stainless steel tray	Amazon	B08CV33YXG	Sporulation
Stainless steel twizzers	Amazon	B01JTZTAJS	Sporulation
Stir Bars	Amazon	B07C4TNKXB	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Submersible circulation pump 400 GPH	Amazon	B07RZKRM13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Submersible Spherical Quantum Sensor	Waltz	US-SQS/L	Monitoring
Temperature gun	Infrared Thermometer 749	B07VTPJXH9	Monitoring
Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture	Sigma	T1270-25G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA	Thermo Fisher	AC157850250	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Transparent Acrylic sheet 24×48 inch	Home Depot	202038048	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Tubing water circulation 1''x10 ft	Amazon	B07ZC1PSF3	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
UV light for natural seawater sterilization	Amazon	B018OI7PYS	Natural seawater sterilization
Vacum pump	Amazon	B087XBTPVW	Natural seawater sterilization
Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98%	Sigma	V6629-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA	Thermo Fisher	S89446	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA	Thermo Fisher	S89445	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Water Chiller 200-600GPM	Amazon	B07BHHP71C	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Y-splitters for 4x6mm tubing	Amazon	B08XTJKFCH	Option 1 Small scale – Incubator
Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture	Sigma	Z0251-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment