Veldverzameling en laboratoriumonderhoud van bladerdakvormende reuzenkelp om herstel te vergemakkelijken

Summary

Dit protocol beschrijft de veldverzameling en het regelmatige laboratoriumonderhoud van substraten die zijn ingezaaid met bladerdakvormende reuzenkelp voor gebruik in herstelproeven om het succes en de beperkingen van de ‘groene grind‘-techniek in veldomgevingen aan te pakken.

Abstract

Kroonvormende kelpen zijn essentiële basissoorten, ondersteunen de biodiversiteit en leveren ecosysteemdiensten ter waarde van meer dan 500 miljard dollar per jaar. De wereldwijde achteruitgang van gigantische kelpbossen als gevolg van klimaatgedreven ecologische stressoren onderstreept de noodzaak van innovatieve herstelstrategieën. Een opkomende restauratietechniek die bekend staat als ‘groen grind‘ heeft tot doel jonge kelpen over grote gebieden te zaaien zonder uitgebreide onderwaterarbeid en is een veelbelovend herstelinstrument vanwege de kosteneffectiviteit en schaalbaarheid. Dit video-artikel illustreert een protocol en hulpmiddelen voor het kweken van reuzenkelp, Macrocystis pyrifera. Het biedt ook een bron voor verdere studies om de successen en beperkingen van deze methode in veldomgevingen aan te pakken. We schetsen veld- en laboratoriumgebaseerde methoden voor het verzamelen van voortplantingsweefsel, sporuleren, inoculeren, kweken, onderhouden en monitoren van substraten die zijn ingezaaid met vroege levensfasen met behulp van de ‘groene grind’-techniek. Het protocol vereenvoudigt en centraliseert de huidige herstelpraktijken op dit gebied om onderzoekers, managers en belanghebbenden te ondersteunen bij het behalen van de doelstellingen voor het behoud van kelp.

Introduction

Kroonvormende kelpen (bruine macroalgen in de orde Laminariales) zijn wereldwijd belangrijke basissoorten, die rotsachtige riffen aan de kust in gematigde en Arctische^zeeën domineren1. Deze kelpen vormen structureel complexe en zeer productieve biogene habitats die bekend staan als kelpbossen en die taxonomisch diverse mariene gemeenschappen ondersteunen². Kelpbossen over de hele wereld leveren veel ecosysteemdiensten aan de mens, waaronder commerciële visserijproductie, koolstof- en nutriëntenkringloop en recreatiemogelijkheden, met een totale geschatte waarde van 500 miljard dollar per jaar³.

Ondanks hun substantiële waarde hebben kelpbossen in veel regio’s te maken met toenemende antropogene druk³. Klimaatverandering vormt een van de belangrijkste bedreigingen voor kelps als gevolg van de opwarming van de oceaan op lange termijn in combinatie met de toenemende frequentie van temperatuuranomalieën 3,4,5,6,7. Verhoogde oceaantemperaturen worden in verband gebracht met nutriëntenbeperking⁸, terwijl blootstelling aan hittestress boven fysiologische drempels kan leiden tot sterfte⁹. In combinatie met variabele regionale lokale stressoren⁷ nemen kelppopulaties wereldwijd af met ongeveer 2% per jaar¹⁰ met aanzienlijke verliezen en aanhoudende verschuivingen naar alternatieve gemeenschapsstaten in bepaalde regio’s 6,11,12,13,14. Natuurlijk herstel van kelppopulaties alleen is mogelijk niet voldoende om de omvang van de huidige en verwachte verliezen ongedaan te maken 15,16,17,18, wat het belang van actief herstel onderstreept.

De huidige inspanningen voor het herstel van kelp kunnen een combinatie van methodologieën gebruiken om deze belangrijke basissoorten op rotsachtige riffen aan de kust te herstellen ^3,19. Methodologieën die worden gekozen om locatiespecifieke problemen aan te pakken, zijn afhankelijk van de geografische context, de specifieke belemmeringen voor het herstel van kelp en de sociaal-ecologische context¹¹. Inzicht in de verbanden en onderlinge afhankelijkheid van sociaal-ecologische systemen is de sleutel, en interventies die lokale instellingen betrekken en steun krijgen van lokale gemeenschappen, vergroten de kans op succesvolle herstelinspanningen²⁰.

Naast klimaatverandering drijft, vermindert of onderdrukt de druk van herbivoren of interspecifieke concurrentie het herstel (bijv. door zee-egels¹³, herbivore vissen^21,22, grasalgen ^9,23 of invasieve algen²⁴). Herstel kan gericht zijn op het verwijderen van deze biotische stressoren²⁵, hoewel deze methoden aanzienlijke middelen en continu onderhoud vereisen¹¹. Om het herstel van kelpsoorten te katalyseren, zijn er inspanningen geleverd voor een directe zaaibenadering, bijvoorbeeld het wegen van netzakken gevuld met vruchtbare kelpbladen voor het benthos dat zoösporen in het milieu afgeeft²⁶. Deze methode is echter tijdrovend en vereist technische installatie en verwijdering onder water. Andere gevallen richten zich op het transplanteren van grote hoeveelheden hele volwassen donorplanten, die nauw verwante en kwetsbare donorpopulaties in gevaar kunnen brengen en vaak beperkt zijn tot kleine schaal vanwege de afhankelijkheid van voortdurende transplantatie²⁷.

Voor regio’s waar de beperking van kelpsporen het herstel van kelpbossen kan belemmeren als gevolg van versnippering van habitats, werd een relatief nieuwe aanpak voor het herstel van kelp, de ‘groene grind’-techniek, geïntroduceerd. De techniek werd met succes getest in het onderzoeksstation Flødevigen in het zuiden van Noorwegen²⁸ en vormde een veelbelovende optie voor restauratie vanwege de kosteneffectiviteit en schaalbaarheid. De workflow van deze techniek is als volgt: (1) een sporenoplossing wordt gemaakt van vruchtbaar weefsel dat is verzameld uit reproductieve volwassen kelps in het veld en vervolgens wordt gezaaid op kleine substraten, zoals grind; (2) kelpen in een vroeg stadium worden gekweekt in laboratoriumgecontroleerde abiotische omstandigheden op substraten; (3) substraten met zichtbare sporofyten worden in het veld ingezet op specifieke riffen als ‘groen grind’, waar sporofyten blijven groeien. Merk op dat typische transplantatie-inspanningen van volwassen individuen een moeizame en kostenremmende onderwaterinstallatie door duikers vereisen, en de ‘groene grind‘-techniek maakt gebruik van eenvoudige inzet vanaf het oppervlak²⁸.

De ‘groene grind’ -techniek wordt momenteel uitgeprobeerd door leden van tal van internationale werkgroepen²⁹ in verschillende omgevingen en verschillende laminaire kelpsoorten. Dit protocol beschrijft de vereiste faciliteiten, materialen en methoden voor weefselverzameling, sporulatie, zaaien, kweekomstandigheden, regelmatig onderhoud en monitoring van kelp in een vroeg stadium voordat deze hersteltechniek in het veld wordt ingezet met behulp van de gigantische kelp, Macrocystis pyrifera. Dit protocol is een waardevolle bron voor onderzoekers, managers en belanghebbenden die inzicht willen geven in de successen en beperkingen van deze methode met M. pyrifera in verschillende veldomgevingen.

Protocol

Kelpweefsels die werden gebruikt zoals beschreven in dit protocol werden verzameld en gecontroleerd door het California Department of Fish and Wildlife onder vergunning S-202020004-20205-001. 1. Voorbereiding van faciliteiten en materialen Zorg ervoor dat kelpkweekfaciliteiten de temperatuur kunnen handhaven (10-15 °C), licht met een volledig spectrum kunnen leveren (0-180 μmol fotonen m-2 s-1) en beluchting kunnen filteren (0.2 μm poriegrootte). Gebruik incubatorsystemen met een ingebouwd stopcontact of een toegangspoort voor draden en slangen, lampen en een luchtbron (Figuur 1). Als een incubatorsysteem niet binnen de reikwijdte, het budget of de beoogde schaal van het project valt, gebruik dan waterbaden die worden getemperd door koel, natuurlijk zeewater of een koelmachine (Figuur 2). Raadpleeg de Materiaaltabel voor specifieke details.Plaats een thermometer in het groeimedium of gebruik een temperatuurpistool om ervoor te zorgen dat de temperatuur tussen de 10-18 °C ligt.OPMERKING: De opfoktemperaturen zijn plaats- en seizoensspecifiek30. Programmeer full-spectrum lampen tot een fotoperiode van 12 uur licht: 12 uur donker door de timinginstellingen op de lichtbron te wijzigen of door een mechanische timer te gebruiken. Meet de lichtintensiteit met een waterdichte fotosynthetisch actieve straling (PAR) kwantummeter onder het oppervlak in de buurt van het grind en pas deze aan met behulp van een dimbare lichtbron of door cellofaan in lagen aan te brengen (in het geval van vegetatieve gametofytenkweek, zie rubriek 9) of gaas over de lichtbron (zie paragraaf 6.3 voor details over het aanpassen van de lichtintensiteit). Zorg voor een goede beluchting door een dag na sporulatie luchtpompen31 te gebruiken. Gebruik filters (0,2 μm poriegrootte) om bacteriële besmetting via de lucht te verminderen.OPMERKING: Voor het kweken van “groen grind” moet de beluchtingsdruk voldoende zijn om het water in alle kweekcontainers te laten circuleren, zonder de hechting van kelp in een vroeg stadium aan gezaaide substraten te verstoren. Als er sprake is van bulkende gametofytenbiomassa (zie punt 9.2), moet de beluchtingsdruk voldoende zijn om gametofyten in de voedingsbodems te laten zweven. Steriliseer materialen en stations. Bereid deze van tevoren voor (zie Tabel met materialen).Reinig oppervlakken met 70% isopropylalcohol. Behandel reproductief soriweefsel en schone verzamelapparatuur buiten de kwekerij van ‘groen grind’, indien mogelijk. Gebruik de volgende sterilisatiemethoden: spoelen met een reinigingsmiddel van laboratoriumkwaliteit, gevolgd door een grondige spoeling met gedestilleerd water, weken in een verdunde bleekoplossing (volgens de aanwijzingen van de fabrikant) gevolgd door een grondige spoeling met gedestilleerd water en autoclaaf met behulp van de juiste instellingen (glaswerk of instrumenten). Na sterilisatie kunnen materialen worden opgeslagen in een afgesloten container of worden omwikkeld met folie. Schrob en reinig containers met de deksels die voor het kweken moeten worden gebruikt met een reinigingsmiddel van laboratoriumkwaliteit, gevolgd door een grondige spoeling met gedestilleerd water.OPMERKING: Kweekcontainers met deksel helpen de verdamping van groeimedia te verminderen. Laat de deksels een beetje open staan om luchtverversing mogelijk te maken, of gebruik een terugslagklep om verontreiniging in de lucht te verminderen. Als er geen containers met deksel beschikbaar zijn, sluit dan kweekcontainers af met een thermoplast zoals paraffinefolie en maak 2-3 perforaties. Als er grotere tanks worden gebruikt, gebruik dan anti-verdampingsdeksels van transparant plastic. Zorg ervoor dat grind een gestructureerd of licht ontpit oppervlak heeft, aangezien gametofyten meer kans hebben om vast te houden op substraten met een hoge ruwheid32,33. Schrob en spoel grind af totdat het water helder is om stof of vuil te verwijderen. Week het grind gedurende ten minste 24 uur in een 10% verdunde bleekoplossing en spoel het af met gefilterd zeewater (zie rubriek 2.1). U kunt ook na het schrobben en spoelen het grind 1 week laten weken in gedeïoniseerd (DI) water32.OPMERKING: Idealiter wordt lokaal geoogst substraat gebruikt om verontreiniging van de herstellocatie te verminderen. Als alternatief wordt grind van aquariumkwaliteit aanbevolen. Vermijd kalkhoudende substraten zoals kalksteen, die kunnen leiden tot weefselverbleking en daaropvolgende sterfte van getransplanteerde kelpen32. 2. Bereiding van groeimedia Filter en steriliseer zeewater volgens de volgende methoden, afhankelijk van de beschikbaarheid van hulpbronnen. Bereken de hoeveelheid gefilterd zeewater die nodig is om kweekcontainers elke week te verversen (zie hoofdstuk 7) en plan deze filtratie-/sterilisatietaak dienovereenkomstig. Bewaar grote hoeveelheden gefilterd zeewater maximaal 6 maanden in donkere containers bij 8-10 °C. Als er geen koeling beschikbaar is, bewaar deze dan op een donkere, koele plaats.Filter water met behulp van een vacuümfiltratiesysteem met een poriegrootte van 0,55-1 μm. Schakel de vacuümbron uit voordat al het water erdoorheen is getrokken om beschadiging van het filter te voorkomen, en giet het gefilterde water in een speciale steriele container. Gebruik voor grotere volumes een doorstroomfiltersysteem. Laat bijvoorbeeld zeewater door een reeks van drie geplooide filters (10 μm, 5 μm en 1 μm) lopen, gerangschikt van de grootste naar de kleinste poriegrootte.OPMERKING: Als natuurlijk zeewater niet toegankelijk is, kan kunstmatig zeewater worden bereid. Als alternatief kan natuurlijk zeewater in bulk worden gekocht bij aquariumwinkels en wordt het vaak gefilterd, ontsmet en pH-gebalanceerd. Mediaverrijking is nog steeds nodig voor deze opties. Steriliseer gefilterd zeewater met behulp van UV- en/of autoclaafmethoden. Sluit doorstroomsystemen aan op een UV-aquariumlamp met een door de fabrikant aanbevolen debiet. Autoclaaf zeewater in autoclaafbestendig glaswerk met licht geopende deksels of afgedekt met folie en op een vloeistofcyclus (121°C; 1-2 PSI, 15-30 min, afhankelijk van het vloeistofvolume34.OPMERKING: Autoclaveren van gefilterd zeewater wordt aanbevolen voor de vroege stadia van de kweek. Verrijking van gefilterd zeewater met voedingsstoffen en vitamines is van cruciaal belang voor de groei van M. pyrifera. Provasoli verrijkt zeewatermedium (PES) is een veelgebruikt medium dat is ontworpen voor algenculturen35. Koop deze media bij algenkweekcentra. Preparaten van PES en aanvullende vitaminen voor de groei van M. pyrifera worden beschreven in34.Verrijk elke 1 L gefilterd zeewater met 20 ml PES. U kunt ook kweekmedia op industrieel niveau gebruiken. Bewaar verrijkingsoplossingen volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Verrijk filtergesteriliseerd zeewater wanneer groeimedia nodig zijn om degradatie van verrijkingsoplossingen te voorkomen. 3. Inzameling in het veld Bepaal de timing van sporofylcollecties om de natuurlijke voortplantingscyclus van lokale M. pyrifera-populaties na te bootsen. Raadpleeg lokale experts (bijv. kelponderzoekers, managers, ecologen, burgerwetenschappers, duikgroepen) om te zorgen voor de juiste timing voor het verzamelen van sporofyl. Verkrijg de nodige vergunningen voor het verzamelen van kelpweefsel die voldoen aan de lokale wet- en regelgeving. Dit kan een tijdrovend onderdeel zijn van het teeltproces en moet worden opgenomen in de tijdlijnen van het project. Door een zelfstandig onderwaterademhalingsapparaat (SCUBA) om 3-5 sporofylbladen te selecteren uit 10-15 vruchtbare M. pyrifera-individuen met zichtbare sori, op een afstand van ten minste 2 m van elkaar. Selecteer indien mogelijk schone en intacte sporofyllen met weinig tot geen vervuiling of degradatie. Bewaar sporofylmessen vanaf dit moment apart volgens de ouderpersoon.OPMERKING: Sporofyllen groeien in een dichte “rok” aan de basis, boven het houvast van de volwassen kelp, en kunnen worden geïdentificeerd door hun gebrek aan met gas gevulde pneumatocysten1. Rijp sorusweefsel is vaak iets verhoogd en donkerder van kleur dan omringend weefsel1. Vervoer sporofylmessen in donkere opvangzakken om overmatige blootstelling aan zonlicht te voorkomen, met minimaal zeewater van de locatie om messen nat te houden, en bewaar ze in koelers bij ongeveer 12 °C tot aankomst in de kweekruimte. Zorg ervoor dat monsters niet in direct contact komen met ijs.OPMERKING: Sporofyllen kunnen van of naar andere locaties worden verzonden.Spoel sporofyllen af met zeewater. Wikkel de messen, verzameld van een enkel M. pyrifera-individu , in vochtige papieren handdoeken gedrenkt in zeewater en opnieuw in aluminiumfolie om lichtpenetratie en extra uitdroging te voorkomen36. Deze manier van bewaren staat algemeen bekend als de “burrito-methode”. Plaats deze pakketten in een koelbox met ijs, met een beschermende barrière zoals gerecycled noppenfolie of karton. Maak de koeler klaar voor verzending ‘s nachts. Zorg ervoor dat er iemand beschikbaar is om de zending in ontvangst te nemen en plaats de pakketten in gekoelde omstandigheden. 4. Sporulatie Verwerk sporofyllen indien mogelijk in een temperatuurgecontroleerde omgeving tussen 10-15 °C en uit de buurt van andere culturen. Bereid instrumenten en stations van tevoren voor en steriliseer ze. Draag beschermende handschoenen bij het hanteren van kelpweefsel om besmetting te verminderen. Bewaar sporofyllen optioneel gedurende 12-48 uur in gekoelde omstandigheden, waardoor het vrijkomen van sporen uit het sorusweefsel wordt aangemoedigd37. Gebruik voor het bewaren de “burrito-methode” zoals beschreven in rubriek 3.3. Selecteer rijp sorusweefsel en knip het met een steriele schaar in25 cm 2 secties. Selecteer 1-2 schone sori-secties van 10-15 individuele kelp-ouders om de genetische diversiteit te bevorderen.OPMERKING: Indien bewaard, eventueel bewijs van gedeeltelijke sporulatie op de papieren handdoeken vinden, wat wijst op de aanwezigheid van vruchtbaar sorusweefsel. Sorusweefsel is vaak iets verhoogd en donkerder van kleur dan omringend weefsel. Om schoon te maken, schrobt u beide zijden van het sorusweefsel voorzichtig in één richting, slechts met een steriel gaasje dat is bevochtigd met gefilterd zeewater. Schraap indien nodig het sorusweefsel voorzichtig met een steriel scheermesje om vervuiling volledig te verwijderen. Dompel het sorigedeelte 30 s tot 1 minuut onder in een zoetwaterbad en spoel af met gefilterd zeewater.NOTITIE: Ververs het zoetwaterbad en steriliseer de gebruikte materialen bij het hanteren van verschillende sori-secties van verschillende personen om kruisbesmetting te verminderen. Dompel elke sorisectie onder in gefilterd zeewater dat is getemperd tot 10-15 °C in een steriele centrifugebuis van 50 ml. Plaats buisjes bij 4-12 °C in het donker om maximaal 4 uur te sporuleren. Als er geen koelkast beschikbaar is, bewaar deze dan op een koele plaats met weinig licht.OPMERKING: Als alternatief kunnen sori-secties worden gesporuleerd in een enkele, steriele container. Observeer met behulp van een samengestelde microscoop en hemocytometer de sporendichtheid van 3-4 monsters elke 30 minuten tot 4 uur. Verwissel de pipetpunten tussen de monsters. Als de dichtheid ten minste 10.000 sporen ml-1 is (zie paragraaf 5.1.1), ga dan verder met de volgende stap. Als een sori-sectie na 4 uur geen sporen produceert, gooi het monster dan weg. Sporen kunnen zich binnen enkele uren na het vrijkomen nestelen, maar kunnen in een cirkelvormige beweging worden waargenomen. Verwijder elk sori-gedeelte uit de buisjes met een steriel pincet. Combineer de resulterende sporenoplossingen in een enkele, gesteriliseerde container en kwantificeer de uiteindelijke gecombineerde dichtheid. 5. Inenting Bereken het uiteindelijke volume sporenoplossing dat nodig is voor inoculatie. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie ongeveer 500-1.000 sporen ml−1 is in kweekcontainers.Om de concentratie van het gecombineerde sporenmonster te berekenen op basis van tellingen van het middenrooster van de hemocytometer, deelt u de telling door 10-4 ml (wat het volume van de oplossing vertegenwoordigt dat in de hemocytometer wordt bekeken). Om het volume van de sporenoplossing te bepalen dat aan elke container moet worden toegevoegd, bepaal je de hoeveelheid groeimedia die nodig is om substraten onder te dompelen in kweekcontainers. Om het totale aantal sporen in elke container te vinden, vermenigvuldigt u dit zeewatervolume met de gewenste concentratie. Om het totale volume van de toe te voegen sporenoplossing te bepalen, deelt u de totale hoeveelheid sporen door de concentratie sporen per ml in de sporenoplossing. Plaats steriele glasplaatje(s) in kweekcontainers om de ontwikkeling van kelp te volgen. Voeg ten minste 30 objectglaasjes toe die willekeurig over kweekcontainers zijn verdeeld voor voldoende monitoring (zie details in rubriek 7). Inoculeer het berekende volume sporenoplossing in de kweekcontainer met behulp van een steriele pipetpunt die substraten bevat die zijn ondergedompeld in groeimedia. Sluit de container en roer voorzichtig om de sporen te verdelen. Sluit de container af en plaats deze in het kweeksysteem. 6. Omstandigheden bij de opfok Stel de temperatuur in tussen 10-15 °C op basis van de temperatuur op de inzetlocatie. Zorg na 1 dag voor lichte beluchting met een gefilterde luchtbron. Stel full-spectrum LED-lampen voor waterplanten in op een 12 uur licht: 12 uur donkercyclus, met lichtintensiteiten variërend van 0-180 μmol foton m-2 s-1:Stel de lichtintensiteit in op 5-10 μmol foton m-2 s-1 van 0-1 dag en verhoog tot 20 – 30 μmol foton m-2 s-1 tot het einde van 1 week. Verhoog vanaf dit punt de bestralingssterkte met 10-20 μmol foton m-2 s-1 elke 3-4 dagen tot het bereiken van een bestralingssterkte van 180 μmol foton m-2 s-1 aan het einde van 6 weken. Ga door met het kweken van culturen bij 180 μmol foton m-2 s-1 tot het einde van 8 weken, of wanneer sporofyten ongeveer 1-2 cm lang zijn geworden. 7. Toezicht Controleer de eerste twee weken dagelijks/om de dag ten minste twee willekeurige glasplaatjes om de ontwikkeling te beoordelen.Om dit te controleren, hanteert u het objectglaasje met een gesteriliseerd pincet en plaatst u het in een schone petrischaal met voldoende gesteriliseerd zeewater om het glaasje onder te dompelen. Breng glasplaatjes niet terug naar culturen nadat ze zijn verwijderd om kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik een samengestelde of omgekeerde microscoop met een vergroting van 40-400x om kelps in een vroeg stadium te observeren. Volg de ontwikkeling met de volgende tijdlijn (zie figuur 3 voor voorbeelden van ontwikkelingsfasen in de levensgeschiedenis).OPMERKING: Neergeslagen sporen worden waargenomen bij 0-1 d. Sporen kunnen binnen enkele uren ontkiemen, zoals blijkt uit de vorming van een kiembuis. Kieming wordt meestal waargenomen bij 1-2 d. Vroege gametofyten worden meestal waargenomen bij 1-4 d. Gametogenese, het proces waarbij cellen deling en differentiatie ondergaan om mannelijke en vrouwelijke gameten te vormen, wordt meestal waargenomen binnen de eerste twee weken. Vrouwelijke cellen zijn 5-7 keer groter dan mannelijke. Mannelijke gametofyten groeien dunne, draadvormige takken, terwijl vrouwtjes meer rond of eivormig zijn. Vrouwtjes produceren meestal eieren of eicellen binnen 2-3 weken. Sperma dat vrijkomt van de mannetjes zwemt naar de vrouwtjes en bevrucht de eieren, wat resulteert in de vorming van diploïde zygoten. Het hebben van de juiste inoculatiedichtheid zorgt voor een succesvolle voortplanting door nabijheid38,39. Bevruchte eicellen ontwikkelen zich tot embryonale sporofyten. Sporofyten worden doorgaans binnen 2-4 weken waargenomen. De zygote ondergaat een snelle celdeling, wat resulteert in de groei van bladen van 1-2 cm binnen ongeveer 6-8 weken. Controleer na twee weken 1-2 keer per week ten minste twee willekeurige glasplaatjes op gezonde groei en besmetting totdat sporofyten 1-2 cm groot zijn.OPMERKING: Gezonde groei wordt gekenmerkt door goudbruine (in tegenstelling tot groene of transparante) kleuring. Er zijn verschillende kwantitatieve maatstaven die kunnen worden waargenomen op objectglaasjes met een omgekeerde microscoop, waaronder overleving, kiemkracht, vegetatieve ontwikkeling, reproductieve rijpheid en vruchtbaarheid, en geslachtsverhouding40. Beoordeel besmetting door bacteriën, schimmels, ciliaten en diatomeeën met een microscoop. Verwijder geïsoleerde verontreinigingen. Vroege tekenen van diatomeeënbesmetting onder controle houden met behandeling met germaniumdioxide (GeO2) (zie rubriek 8.3). 8. Onderhoud Pas de lichtomstandigheden aan volgens paragraaf 6.3. Vervang elke week van groeimedium om de nodige voedingsstoffen en mineralen voor de groei van M. pyrifera aan te vullen.Koel verse groeimedia tot de juiste temperatuur. Zorg ervoor dat de temperatuur tijdens dit proces niet hoger is dan 15 °C. Hevel media uit de kweekcontainers om verstoring van de gezaaide substraten te voorkomen. Laat het medium uitlekken totdat de container bijna leeg is. Ververs media onmiddellijk om uitdroging tot een minimum te beperken. Kantel ze bij het bijvullen van kweekbakken een beetje, zodat het medium langs de zijkant van de kweekbak loopt om de substraten minimaal te verstoren. Herschik willekeurig de posities van containers of kuipen tijdens wekelijkse mediawisselingen om rekening te houden met verschillen in lichtstraling.OPMERKING: Zie Aanvullend bestand 1 voor een kalender om activiteiten en verwachtingen voor Macrocystis-culturen bij te houden. Het geeft de timing aan van aanpassingen aan licht en beluchting, evenals wekelijkse mediawisselingen. Optioneel kunt u diatomeeëncontaminatie bestrijden met een behandeling met germaniumdioxide (GeO2). Voeg 0,3-0,5 ml 250 mg/ml GeO2 toe aan elke 1 L zeewater die aan de gezaaide substraten wordt toegevoegd om wijdverspreide diatomeeënbesmetting te verminderen.OPMERKING: GeO2 kan de productie van algengameten remmen. Breng een behandeling met GeO2 aan in de korte periode na ontkieming en vóór pieken in de ei- en spermaproductie (1-7 d) en/of na eicelbevruchting en sporofytenwaarnemingen (>21 d), gevolgd door een mediawissel 48 uur later om de chemische stof te verwijderen. Deze tijdlijnen kunnen variëren afhankelijk van de kweekomstandigheden, dus het monitoren van de ontwikkeling van de levensfase met microscopie is de beste manier om de timing van GeO2-toepassing te beoordelen. Als de diatomeeënbesmetting aanhoudt in kweekcontainers en overgroei op kelpen in een vroeg stadium wordt waargenomen, overweeg dan om de substraten opnieuw in te zaaien. 9. Vegetatieve gametofytenteelt met reuzenkelp Verspreid het hele jaar door gametofytenculturen in vegetatieve omstandigheden om de afhankelijkheid van seizoensgebonden sporofylverzameling van het natuurlijke rif te verminderen.Bewaar gametofytculturen volgens de bronpopulatie in kolven gevuld met groeimedia bij 4-12 °C in rood licht met een intensiteit van 5-20 μmol foton m-2 s-1 in een 12 licht: 12 donkere cyclus. Zorg voor constante beluchting en vervang media elke 2-6 maanden. Om de biomassa van gametofyten die ongeslachtelijk zijn gegroeid op te vullen voor gebruik bij het zaaien van ‘groen grind’, verhoogt u de beluchting om gametofyten op te schorten, verhoogt u de frequentie van mediawisselingen tot wekelijks en fragmenteert u gametofyten om de twee weken.Suspendeer de biomassa van gametofyten in de kweekkolf door te schudden of te roeren en schraap de zijkanten van de kweekkolf zo nodig met een steriel gereedschap om aangehechte gametofyten los te maken. Giet de gesuspendeerde gametofyten in een steriele blender of koffiemolen en pulseer de gametofytenoplossing gedurende 1-2 s ongeveer 5-15 keer, afhankelijk van de biomassaconcentratie, totdat er geen samengeklonterde massa’s meer zichtbaar zijn. Om de voortplanting voor het zaaien van “groen grind” te induceren, moeten gametofyten worden gefragmenteerd, zoals hierboven uitgelegd. Inoculeer vervolgens het substraat en verhoog het full-spectrum LED-licht van 5-20 tot 45-60 μmol foton m-2 s-1 (+10 μmol foton m-2 s-1 per dag voor foto-acclimatisatie), verhoog vervolgens met 10-20 μmol foton m-2 s-1 elke 3-4 d tot het bereiken van een bestralingssterkte van 180 μmol foton m-2 s-1. 10. Implementatie Zorg er na 6-8 weken laboratoriumkweek voor dat juveniele sporofyten 1-2 cm lang zijn en klaar voor inzet (Figuur 4). Ververs groeimedia in kweekcontainers 24 uur voor implementatie. Verkrijg de benodigde vergunningen voor het inzetten van grind die voldoen aan de lokale wet- en regelgeving. Dit kan een tijdrovend onderdeel zijn van het teeltproces en moet worden opgenomen in de tijdlijnen van het project. Vervoer ‘groen grind’ in trays bedekt met handdoeken gedrenkt in zeewater om de kelp gehydrateerd te houden. Plaats trays in geïsoleerde koelers met ijs en zorg ervoor dat ze niet in direct contact komen met ijs. Zorg ervoor dat het ‘groene grind’ dicht opeengepakt is om te voorkomen dat de substraten tijdens het transport gaan rollen en sporofyten loskomen.OPMERKING: Afhankelijk van de beschikbare ruimte kunnen substraten ook in hun kweekcontainers of kuipen worden vervoerd om het hanteren te verminderen. Vervoer ‘groen grind’ tot 6 uur in een schaduwrijke koelbox. De inzet moet zo worden getimed dat het meest directe zonlicht wordt vermeden. Als u vanaf een boot inzet, gebruik dan een schaduwrijke structuur om direct zonlicht tijdens het inzetproces te vermijden. Strooi voorzichtig ‘groen grind’ van het oppervlak op het rif eronder of via SCUBA bij het testen op nieuwe locaties en op kleine schaal.

Representative Results

De hersteltechniek van ‘groen grind’ bevindt zich nog in de pilotfase, met beperkte gegevens over de overleving van andere soorten28 en nog geen gepubliceerde gegevens voor Macrocystis pyrifera. Met behulp van de veldverzameling en het laboratoriumonderhoud die in dit protocol worden beschreven, hebben we de betekenis van locatiespecifieke kweekomstandigheden voor twee verschillende donorkelppopulaties getest voordat hypothetische ‘groene grind’ -inzet (Figuur 5). Reproductief kelpweefsel werd verzameld in Californië (VS) van koelere K1 (Santa Cruz 36.60167 ° N, 121.88508 ° W) en warmere K4 (San Diego, 32.85036 ° N, -117.27600 ° W) populaties en gekweekt bij twee temperaturen: (1) 12 °C (de standaard kweektemperatuur voor zeewieraquacultuur en de gemiddelde winter-SST voor K1), en (2) 20 °C (de gemiddelde zomer-SST voor K4, en een hittegolf van 4 °C voor K1). Alle glasplaatjes die werden gebruikt voor het volgen van de ontwikkeling van de levensfase van kelp werden gemarkeerd met een gestandaardiseerd raster en beelden met een hoge resolutie werden vastgelegd met dit raster als referentie om de waarneming van vaste velden door de tijd heen mogelijk te maken met behulp van een omgekeerde microscoop en camera (N = 5 beelden per monster, 2,479 mm x 1,859 mm). Na 24 dagen na sporulatie werden gametofyten geteld op basis van microscoopbeelden (N = 300 beelden van 60 monsters). Om te testen op verschillen in het aantal gametofyten, werden gegeneraliseerde lineaire modellen met gemengde effecten gebruikt met Poisson-verdeling met behulp van de functie glmmTMB() in pakket glmmTMB41, en paarsgewijze vergelijkingen werden uitgevoerd met emtrends() van pakket emmeans42in R. Onze resultaten illustreren dat de respons van gametofyten op thermische variabiliteit verschillend was tussen K1- en K4-populaties (t = 2,7, p = 0,007), waarbij temperatuur geen effect had voor de warmere K4-populatie (schatting = -0,01, standaardfout [SE] = 0,01, betrouwbaarheidsinterval [CI] = [-0,03, 0,01]), maar wel een effect had voor de koelere K1-populatie (schatting = -0,06, SE = 0,02, BI = [-0,10, -0,03]) (Figuur 6A), wat wijst op een mogelijke adaptieve divergentie in thermische tolerantiekenmerken. Kelp-gametofyten worden vaak afgebeeld als een resistentiestadium43, wat betekent dat ze een universeel fenotype produceren dat stresstolerant is en relatief ongevoelig voor omgevingsvariabiliteit. Deze resultaten geven echter aan dat thermische variabiliteit in dit vroege stadium een aanzienlijke druk oplegt. Na 32 dagen na sporulatie werden zichtbare sporofyten met een lengte groter dan ongeveer 1 mm geteld op het geheel van elk objectglaasje van 2,5 cm bij 7,5 cm (N = 72 totale monsters). Om te testen op verschillen in zichtbare sporofytentellingen, werden gegeneraliseerde lineaire modellen met gemengde effecten gebruikt met Poisson-verdeling met behulp van de functie glmmTMB() in pakket glmmTMB en paarsgewijze vergelijkingen werden uitgevoerd met emtrends() van pakketemgemiddelden in R. Onze resultaten illustreren dat de respons van sporofyten op thermische variabiliteit vergelijkbaar is tussen K1 en K4 gedifferentieerde populaties (z = 0,92, p = 0,36), waarbij de temperatuur een effect had voor de warmere K4 populatie (schatting = -0,66, SE = 0,04, CI = [-0,74, – 0,57]), evenals de koelere K1 populatie (schatting = -0,85, SE = 0,13, CI = [-1,10, -0,60]) (Figuur 6B). In de monsters die bij 20 °C werden gekweekt, waren weinig zichtbare sporofyten (gemiddelde ± SE = 0,4 ± 0,2) in vergelijking met monsters die bij 12 °C werden gekweekt (gemiddelde ± SE = 82,4 ± 9,8). Dit resultaat suggereert dat de productie van sporofyten gevoeliger is voor temperatuur dan het gametofytstadium, en dat locatiespecifieke kweektemperaturen niet hoger mogen zijn dan 15 °C om sporofytenontwikkeling te bereiken, zoals beschreven in het protocol. Figuur 1: Diagram van het incubatorsysteem van “groen grind”. (A) Rode lichtbron voor vegetatief ophopende gametofytculturen. (B) Toegangspoort voor elektrische draden en buizen, die leidt naar een extern stopcontact. (C) Structuur om licht met een volledig spectrum uit het roodlichtgedeelte te blokkeren. (D) Een “groen grind”-teeltgedeelte. (E) lichtbronnen met volledig spectrum. (F) Slangleidingen die zijn aangesloten op een externe gefilterde luchtbron. (G) Terugslagkleppen om verontreiniging in de lucht te verminderen. (H) Individuele kweekcontainers die besmetting tot een minimum beperken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Diagram van het waterbadsysteem met groen grind . (A) Koelmachine met dompelpomp (in I). (B) Kuip van 20 gallon voor waterbad. (C) Giet af om het waterbad te recirculeren. (D) Klep voor recirculatie van het waterbad. (E) Lichtbron. F) Container van 2,5 l “groen grind” met transparant deksel en beluchtingsopening. (G) Beluchtingsbron. (H) Leidingen die water recirculeren met behulp van ondergedompelde pompen. (I) Waterbadontvanger van/naar koeler van/naar kuipen met dompelpompen. (J) Acryl afdekking om de verdamping van het waterbad tot een minimum te beperken. (K) Gaaskap om de lichtintensiteit aan te passen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Ontwikkeling van Macrocystis pyrifera . Ontwikkelingsstadia van de levensgeschiedenis van Macrocystis pyrifera uit laboratoriumgroeiproeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: ‘Groen grind’ bezaaid met Macrocystis pyrifera. ‘Groen grind’ ingezaaid met Macrocystis pyrifera wordt in het laboratorium gekweekt tot sporofyten 1-2 cm bereiken. ‘Groen grind’ wordt dan ingezet en groeit verder in het veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Experimentele tijdreeksen. Voorbeeldbeelden van een tijdreeks na de experimentele groei en ontwikkeling van Macrocystis pyrifera , gametofyten en sporofyten, afkomstig van twee populaties verzameld in Californië (VS) en gekweekt bij twee verschillende temperaturen. K1 = Santa Cruz, K4 = San Diego. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Representatieve resultaten. Macrocystis pyrifera levensstadia waargenomen voor K1 Santa Cruz San Diego K4 Santa Cruz populaties van oorsprong gekweekt bij constante thermische omstandigheden van 12 en 20 °C. Foutbalken, gemiddelde ± 1 SE. Asterisk (*) geeft statistisch significante verschillen aan (p < 0,05). (A) Gametofyten op dag 24 (N = 300 totale beelden van 60 monsters). (B) Zichtbare sporofyten op dag 32 (N = 72 monsters, binnen een gestandaardiseerd gebied van 2,5 cm bij 7,5 cm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Antropogene klimaatverandering is een groeiende bedreiging voor de gezondheid van de oceanen in de wereld 44,45,46,47,48, wat resulteert in grote verstoringen en verlies aan biodiversiteit 49,50,51,52. Om het herstel van aangetaste ecosystemen te versnellen, hebben de Verenigde Naties 2021 tot en met 2030 uitgeroepen tot het “VN-decennium voor het herstel van ecosystemen”, dat samenvalt met het “VN-decennium van oceaanwetenschap voor duurzame ontwikkeling”, dat tot doel heeft de verslechtering van de gezondheid van de oceaan om te keren⁵³. In lijn met deze wereldwijde oproep tot actie heeft de Kelp Forest Alliance de Kelp Forest Challenge gelanceerd om tegen het jaar 2040 1 miljoen hectare kelpbos te herstellen en 3 miljoen hectare te beschermen⁵⁴. Het herstel van de zee wordt ondergewaardeerd⁵⁵ en kelp-ecosystemen krijgen aanzienlijk minder aandacht dan habitats zoals koraalriffen, mangrovebossen en zeegrasweiden⁵⁶. Het is aangetoond dat herstel van aangetaste ecosystemen effectief is bij de wederopbouw van mariene ecosystemen, maar kan gemiddeld tussen $ 80.000 en $ 1.600.000 per hectare kosten, waarbij de mediane totale kosten waarschijnlijk twee tot vier^{keer hoger zullen} zijn. Huidige en verwachte verliezen vragen om het ontwikkelen van schaalbare, haalbare en kosteneffectieve methoden voor het herstel van kelp als dringende instandhoudingsinterventies.

De huidige inspanningen voor het herstel van kelp maken gebruik van een combinatie van methodologieën om locatiespecifieke oorzaken van kelpverlies aan te pakken, waaronder transplantatie van volwassen kelpen, directe zaaiing van zoösporen en/of gametofyten, controle van grazers en installatie van kunstmatige riffen¹¹. Deze methoden vereisen echter aanzienlijke middelen en hebben een beperkte schaalbaarheid. Typische transplantatie van volwassen kelpen vereist de moeizame inzet van kunstmatige materialen of structuren op het benthos, door duikers. Bottom-up interventies om rotsachtige riffen aan de kust te herstellen, zoals het beheersen van concurrenten en grazers, worden ook beperkt door arbeidskosten, omdat ze afhankelijk zijn van het handmatig verwijderen of uitsluiten van deze biotische stressoren onder water^. De ‘groene grind ‘-techniek overwint deze beperkingen door ze eenvoudig vanaf het oppervlak in te zetten, zonder dat er onder water installatie of technische kennis nodig is, en schaalbaarheid tegen relatief lage kosten²⁸. Deze innovatieve aanpak biedt een veelbelovend restauratie-instrument, dat aandringt op uitgebreide proeven op verschillende locaties en omgevingen om het volledige potentieel ervan te ontsluiten³².

Hoewel succesvolle herstelinspanningen met ‘groen grind’ zijn gedocumenteerd in beschutte fjorden in Noorwegen met behulp van de suikerkelp, Saccharina latissima²⁶, bevindt deze techniek zich nog in de proeffase voor Macrocystis pyrifera in de oostelijke Stille Oceaan. Aanvullende proeven zijn nodig om de verwachte overleving van M. pyrifera-uitplantingen binnen zijn verspreidingsgebied aan te pakken. In aan golven blootgestelde omstandigheden die typisch zijn voor de groei van M. pyrifera , kan kleiner grind vatbaarder zijn voor beweging en slijtage, wat leidt tot beschadigde uitplanten. Bovendien kan het positieve drijfvermogen van met gas gevulde pneumatocysten van M. pyrifera ertoe leiden dat ‘groen grind‘-uitplantingen effectief worden weggevoerd van de herstellocatie, en daarom zijn de grootte en het gewicht van het grind belangrijke factoren om te onderzoeken voor deze soort. In een recente pilotstudie (mei 2022; Ensenada, Baja California, Mexico), is voorlopig succes in het veld waargenomen met M. pyrifera , wat blijkt uit haptera-hechting aan het omringende substraat en groei van juvenielen die na twee maanden in het veld 1,2 m lang worden (Figuur 4). Dit toont een duidelijke kans aan die nog moet worden onderzocht bij het gebruik van ‘groen grind’ voor M. pyrifera in de oostelijke Stille Oceaan. Deze video toont de ‘groene grind’ -techniek met M. pyrifera en is een waardevolle bron die bestaande praktijken in de kweekfase van restauratie vereenvoudigt en centraliseert om studies te ondersteunen die successen en beperkingen in verschillende veldomgevingen aanpakken.

Met de ‘groene grind‘-techniek kunnen veel kleinere, individuele grindeenheden worden ingezaaid op een schaal die de kans op succes kan vergroten in vergelijking met meer gebruikelijke transplantatiebenaderingen met volwassen planten. Het belangrijkste schaalbare aspect van deze techniek is echter de eenvoudige inzet vanaf het oppervlak, wat het herstel van grote gebieden per boot kan vergemakkelijken. Voor veldomgevingen waar de inzet van klein grind niet geschikt is, kan dit protocol worden aangepast om M. pyrifera te transplanteren op een breed scala aan substraten, waaronder groter grind of zelfs kleine rotsblokken, touw dat kan worden vastgemaakt aan natuurlijke of ingezette onderwaterankers, of tegels die kunnen worden vastgeschroefd of gelijmd met behulp van mariene epoxy op de zeebodem in meer blootgestelde omstandigheden. Deze aanpassingen aan de inzet zullen de faciliteiten die nodig zijn voor de kweek van M. pyrifera niet veranderen, maar zullen vervolgens de kosten van de inzet verhogen.

Antropogene verstoringen en klimaatverandering overwinnen momenteel het aanpassingsvermogen van natuurlijke populaties. Dit vormt een aanzienlijke uitdaging voor traditionele instandhoudingsinspanningen die ecosystemen herstellen in hun historische staat 58,59,60,61,62,63. Zo zijn de instandhoudingskaders uitgebreid met anticiperend beheer, rekening houdend met veerkracht en aanpassingsvermogen⁶⁴. Anticiperend beheer om de klimaatverandering aan te pakken wordt geïmplementeerd voor boomsoorten in bosecosystemen⁶⁵ en is voorgesteld voor verdere herstelinspanningen om het evolutionaire potentieel van uitplanters te vergroten^66,67. Hoewel deze strategieën inherent gemakkelijker te manipuleren zijn in terrestrische omgevingen, beginnen verschillende studies hun toepassing in mariene omgevingen te onderzoeken 62,68,69,70. Koraalriffen worden bijvoorbeeld bedreigd door tal van antropogene stressoren die hebben geleid tot ongekende dalingen^71,72. Als reactie op het verlies van deze belangrijke basissoorten worden steeds vaker actieve herstel- en geassisteerde aanpassingstechnieken bepleit om de resterende koraalriffen en de bijbehorende functies te behouden 62,73,74. Eén techniek omvat het verplaatsen van individuen binnen hun huidige verspreidingsgebied om de tolerantie voor hittestress te vergroten⁷⁵. Wat betreft het herstel van kroonvormende kelpen, heeft ‘groen grind’ een aanpasbaar kader om geassisteerde aanpassingstechnieken te onderzoeken, zoals translocatie van veerkrachtige genotypen naar kwetsbare gebieden, niet-genetische manipulatie zoals hybridisatie of acclimatisatie van individuen aan omgevingsstress⁶² met resultaten gericht op het verkrijgen van meer resistente stammen voor herstelprogramma’s^76,77.

Het benutten van lokale steun om herstelinspanningen te verbeteren, is cruciaal om het succes van het behoud van kelp-ecosystemen te behouden. Het betrekken van lokale belanghebbenden kan de lokale buy-in voor herstelbehoeften^{vergroten 6,50} en kustbeheer bevorderen, wat vervolgens zou kunnen resulteren in meer financiering en een langere levensduur van de bescherming van kelp-ecosystemen. Net als bij alle andere methoden voor het herstel van kelp, zullen gestructureerde besluitvormingskaders die verschillende ecologische, sociaaleconomische en instandhoudingsdoelstellingen integreren, helpen om optimale resultaten te bereiken voor kelp-ecosystemen en de gemeenschappen die ze ondersteunen¹¹.

Materials

0.22 µm filters	Milipore	SCGPS05RE	Natural seawater sterilization
1 L glass bottles	Amazon	B07J6JP4D1	Natural seawater sterilization
1 µm filters (water + air)	Amazon	B01M1VWUWL	Natural seawater sterilization
1'' PVC 90-Degree Elbow	Home Depot	203812125	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
10 µm filters	Amazon	B00D04BG56	Natural seawater sterilization
20 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
3x5mm tubing	Amazon	B0852HXPN6	Option 1 Small scale – Incubator
4×4'' Sterile Gauze	Amazon	B07NDK8XM3	Sporulation
4x6mm tubing	Amazon	B08BCRV1FY	Option 1 Small scale – Incubator
5 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
50 mL falcon tubing	Amazon	B01M04HGPJ	Sporulation
8x10mm tubing	Amazon	B01MSM3LLZ	Option 1 Small scale – Incubator
Air filters	Thermo Fisher	MTGR85010	Option 1 Small scale – Incubator
Alcohol lamp	Amazon	B07XWD9WWC	Sporulation
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99%	Sigma	215406-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Aquarium Grade Gravel	Amazon	B07XRCKFBJ	Option 1 Small scale – Incubator
Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99%	Sigma	B4639-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g	Thermo Fisher	5090113707	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA	Thermo Fisher	P001225G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Check valves	Amazon	B08HRZR4MM	Option 1 Small scale – Incubator
Clear tubing 3/8'' – 10 ft	Amazon	B07MTYMW13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING – California – Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA	Thermo Fisher	5090114752	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Compound microscope with camera	OMAX	M83EZ-C50S	Monitoring
Culture flask	Thermo Fisher	07-250-080	Option 1 Small scale – Incubator
Culture light	Amazon	B07RRRPJ63	Option 1 Small scale – Incubator
Culture stoppers	Amazon	B07DX6J7QD	Option 1 Small scale – Incubator
Drainage connector	Amazon	B00GUZ6CV0	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2	Thermo Fisher	50213299	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL	Thermo Fisher	S81273	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL	Thermo Fisher	S81275	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets – Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye	Thermo Fisher	S81271	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Filter holder	Amazon	B07LCKBKCT	Natural seawater sterilization
Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA	Thermo Fisher	S63460	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
FLEXACAM C1 Camera	Leica	FLEXACAM C1	Monitoring
Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN	Thermo Fisher	AAJ6083314	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Free Standing 20 Gallon Utility Sink	Amazon	B094TLH19L	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR	Thermo Fisher	AC190000100	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA	Thermo Fisher	S88442	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass slides	Amazon	B00L1S93PS	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture	Sigma	G6501-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid	Container store	#10014828	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Growth light	Amazon	B086R14MFW	Option 1 Small scale – Incubator
Hemocytometer	Amazon	B07TJQDKLJ	Sporulation
HEPES 99.5% (titration)	Sigma	H3375-500G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Hinged plastic jars	SKS Bottle & Packaging	40280125.01S	Option 1 Small scale – Incubator
Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size – 100G Storage Conditions – +15 C TO +30 C Catalog Number – 26310.01 CAS 87-89-8	Thermo Fisher	50247745	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Instant Ocean – 50 G	Amazon	B000255NKA	Option 1 Small scale – Incubator
Inverted Microscope Leica DMi1	Leica	DMi1	Monitoring
Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97%	Sigma	236489-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Licor Ligth Meter Data Logger	Licor	LI-250A	Monitoring
Light/temperature HOBO data logger	Amazon	B075X2SWKN	Monitoring
Lights 150W	Amazon	B0799DQM9V	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications	Sigma	M8179-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds	Home Depot	206823930	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11,	Thermo Fisher	AAA1268330	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA	Thermo Fisher	ICN10256925	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
PCV cement	Amazon	B001D9WRWG	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B0006JLVE4	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B07G5FY7X1	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Precision scale 1mg	Amazon	B08DTH95FN	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Pump for filtered air	Amazon	B0BG2BT9RX	Option 1 Small scale – Incubator
PVC tubing 1×24''	Home Depot	202300505	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Quantum Light meter	Apogee Instruments	MQ-510	Monitoring
Refrigerated Incubator	Thermo Fisher	15-103-1566	Option 1 Small scale – Incubator
Rubber Grommets	Amazon	B07YZD22ZP	Option 1 Small scale – Incubator
Salinity refractometer	ATC	B018LRO1SU	Monitoring
Shade mesh 6×50 ft	Home depot	316308418	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA	Thermo Fisher	BP360500	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Soldering for aeration opening	Amazon	B08R3515SF	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Spray isporopyl alcohol	Amazon	‎ B08LW5P844	Sporulation
Stainless steel sissors	Amazon	B07BT4YLHT	Sporulation
Stainless steel tray	Amazon	B08CV33YXG	Sporulation
Stainless steel twizzers	Amazon	B01JTZTAJS	Sporulation
Stir Bars	Amazon	B07C4TNKXB	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Submersible circulation pump 400 GPH	Amazon	B07RZKRM13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Submersible Spherical Quantum Sensor	Waltz	US-SQS/L	Monitoring
Temperature gun	Infrared Thermometer 749	B07VTPJXH9	Monitoring
Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture	Sigma	T1270-25G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA	Thermo Fisher	AC157850250	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Transparent Acrylic sheet 24×48 inch	Home Depot	202038048	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Tubing water circulation 1''x10 ft	Amazon	B07ZC1PSF3	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
UV light for natural seawater sterilization	Amazon	B018OI7PYS	Natural seawater sterilization
Vacum pump	Amazon	B087XBTPVW	Natural seawater sterilization
Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98%	Sigma	V6629-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA	Thermo Fisher	S89446	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA	Thermo Fisher	S89445	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Water Chiller 200-600GPM	Amazon	B07BHHP71C	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Y-splitters for 4x6mm tubing	Amazon	B08XTJKFCH	Option 1 Small scale – Incubator
Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture	Sigma	Z0251-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment