Organoides gástricos derivados de pacientes encontram uso crescente em pesquisas, mas faltam protocolos formais para gerar organoides gástricos humanos a partir de digestores unicelulares com densidade de semeadura padronizada. Este protocolo apresenta um método detalhado para a criação confiável de organoides gástricos a partir de tecido de biópsia obtido durante a endoscopia digestiva alta.
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Artigo de método
Estabelecimento e Caracterização de Organoides Gástricos Derivados de Pacientes a partir de Biópsias do Corpo Gástrico Benigno e Epitélio Antral
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os organoides derivados do paciente gástrico (DOPs) oferecem uma ferramenta única para o estudo da biologia e patologia gástrica. Consequentemente, essas DOPs encontram uso crescente em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. No entanto, existe uma escassez de abordagens publicadas para produzir PDOs gástricas a partir de digeridos de célula única, mantendo uma densidade de semeadura celular inicial padronizada. Neste protocolo, a ênfase está na iniciação de organoides gástricos a partir de células isoladas isoladas e no fornecimento de um método para passar organoides através da fragmentação. É importante ressaltar que o protocolo demonstra que uma abordagem padronizada para a densidade inicial de semeadura celular produz organoides gástricos a partir de tecido benigno de biópsia e permite a quantificação padronizada do crescimento organoide. Finalmente, as evidências apoiam a nova observação de que as DOPs gástricas exibem taxas variáveis de formação e crescimento com base no fato de os organoides se originarem de biópsias do corpo ou de regiões antrais do estômago. Especificamente, revela-se que o uso de tecido de biópsia antral para iniciação organoide resulta em maior número de organoides formados e crescimento organoide mais rápido durante um período de 20 dias quando comparado aos organoides gerados a partir de biópsias do corpo gástrico. O protocolo aqui descrito oferece aos investigadores um método oportuno e reprodutível para gerar e trabalhar com sucesso com DOPs gástricas.
Introdução
Os organoides são estruturas celulares tridimensionais (3D) em miniatura que se assemelham à arquitetura e funcionalidade dos órgãos dos quais foram derivadas 1,2. Esses modelos cultivados em laboratório são criados a partir do cultivo de células-tronco ou células tecido-específicas em um ambiente controlado que permite que essas células se auto-organizem e se diferenciem em vários tipos celulares 1,2,3. Uma das principais vantagens dos organoides é sua capacidade de recapitular a biologia humana mais de perto do que as culturas tradicionais de células bidimensionais (2D) 1,2,3. Em particular, organoides humanos têm demonstrado manter a diversidade genética de seu tecido de origem 3,4,5. Os organoides oferecem uma oportunidade única para estudar o desenvolvimento de órgãos humanos, modelar doenças e testar potenciais terapêuticas em um ambiente laboratorial controlado. Além disso, os organoides podem ser derivados de amostras individuais de pacientes, possibilitando abordagens de medicina personalizada e o potencial desenvolvimento de tratamentos individualizados 3,6,7.
Pesquisadores têm usado organoides gástricos humanos para investigar vários aspectos da biologia e patologia gástrica. Exemplos proeminentes incluem o uso de organoides derivados do paciente (DOPs) para predizer respostas à quimioterapia do câncer gástrico 8,9,10 e modelar a resposta epitelial à infecção pelo Helicobacter pylori 11,12,13. Os organoides gástricos humanos consistem em vários tipos celulares encontrados no estômago, incluindo células do pescoço, células da fossa e outras células de suporte11,14. Os organoides gástricos podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ou células-tronco diretamente isoladas do tecido gástrico obtido por biópsias ou de espécimes de ressecção gástrica11,14. O isolamento de células-tronco gástricas do tecido gástrico é comumente feito por meio do isolamento e cultura de glândulas gástricas ou digestão enzimática de amostras de tecido para liberação de células isoladas 9,13,15. É importante ressaltar que a diferenciação de células dentro de organoides gástricos gerados por qualquer uma dessas técnicas tem se mostrado semelhante13. O protocolo aqui descrito concentra-se em um digesto unicelular.
Os organoides representam uma inovação científica que faz a ponte entre a cultura celular tradicional e órgãos inteiros. À medida que a pesquisa no campo continua a progredir, os organoides estão prontos para contribuir para o desenvolvimento de tratamentos e terapias mais eficazes para uma ampla gama de aplicações. Dada a crescente utilização de DOPs gástricas, há uma necessidade oportuna de uma abordagem padronizada para sua geração. Aqui é descrito o protocolo para geração de DOPs gástricas humanas a partir de células isoladas de tecido de biópsia gástrica benigna adquirida durante endoscopia digestiva alta. Importante e singularmente, um número padronizado de células únicas é determinado para semeadura para gerar PDOs gástricas de forma confiável e permitir a caracterização subsequente. Usando esta técnica, diferenças confiáveis na formação e crescimento de organoides gerados a partir de biópsias do corpo gástrico ou antro gástrico são demonstradas.
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Protocolo
Todo o tecido humano utilizado neste protocolo foi coletado de indivíduos que forneceram consentimento informado para a coleta de tecidos através de um estudo de coleta de tecido gástrico aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia (IRB #842961). Os participantes deste estudo deveriam ser submetidos a uma endoscopia digestiva alta como parte de seus cuidados de rotina, ter pelo menos 18 anos de idade e ser capazes de fornecer consentimento informado. Todas as pesquisas realizadas seguiram as diretrizes estabelecidas pela Universidade da Pensilvânia.
1. Preparação experimental
- Preparar meios L-WRN condicionados conforme descrito anteriormente16. Embora não seja obrigatório, as concentrações de Wnt-3A, R-spondin e noggin contidas no meio condicionado podem ser verificadas usando kits ELISA disponíveis comercialmente seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Preparar RPMI-Antibióticos (RPMI-ABX), PBS-Antibióticos (PBS-ABX), PBS-Ditiotreitol (PBS-TDT), tampão de digestão e meios organoides gástricos (consulte a Tabela Suplementar 1 para composição detalhada). O meio organoide gástrico é estável por 1 semana a 4 °C.
- Pinça de autoclave, tesoura de dissecção fina e tubos de 1,5 mL.
- Comece a descongelar a matriz da membrana basal (Matrigel) no gelo.
- Comece a descongelar o tampão de digestão e a tripsina-EDTA em banho-maria a 37 °C.
- Ajuste um agitador orbital da incubadora para 37 °C e 200 rpm.
2. Isolamento de células isoladas do tecido da biópsia
- Coletar biópsias gástricas durante endoscopia digestiva alta17 seguindo o protocolo clínico institucional, provavelmente envolvendo o uso de pinça jumbo. Utilizar uma agulha romba para extrair amostras de tecido da pinça e colocá-las em um tubo cônico de 15 mL contendo meio RPMI-ABX. Mantenha o tubo no gelo para transferência rápida para o laboratório.
NOTA: No mínimo, 2-4 biópsias devem ser coletadas. - Permitir que o tecido da biópsia se deposite no fundo do tubo cônico. Utilizar pipeta para aspirar o meio e lavar as biópsias duas vezes com 1 mL de tampão PBS-ABX. Não há necessidade de centrifugação, pois as peças de tecido se depositam naturalmente no tubo cônico.
- Transferir um mínimo de 20 mg de tecido de biópsia para um tubo de 1,5 ml contendo 1 ml de PBS-TDT.
- Use tesouras de dissecção fina para cortar o tecido em pedaços de 1-2 mm ou menos.
- Utilize uma minicentrífuga de mesa por 15 s para agregar pedaços de tecido no fundo do tubo e aspirar o máximo de sobrenadante possível. Um pequeno volume residual de PBS-TDT é aceitável.
- Adicionar 5 ml de tampão de digestão recém-aquecido a um tubo cónico de 50 ml. Para transferir os pequenos pedaços de tecido sem perder tecido, pegue 500 μL do tampão de digestão e adicione-o ao tubo de 1,5 mL que contém o tecido. Em seguida, modifique a ponta de uma pipeta de 1000 μL com tesoura para aumentar o diâmetro da ponta, permitindo fácil aspiração e transferência de pedaços de tecido para o tubo cônico de 50 mL contendo o tampão de digestão.
- Incubar o tampão de digestão e a mistura de tecidos a 37 °C durante 30 minutos com agitação orbital a 200 rpm.
- Adicionar 5 mL de tripsina aquecida com EDTA a 0,25% ao tampão de digestão e incubar por mais 10 min a 37 °C com agitação orbital a 200 rpm.
- Neutralizar o tampão de digestão e a tripsina adicionando um volume igual de meio DMEM/F12 avançado (Adv.) e passar a solução através de um filtro celular de 70 μm.
- Pellet as células por centrifugação a 1400 x g durante 4 min a 4 °C. Dependendo do tamanho inicial do tecido da biópsia, uma pastilha de células pequenas pode ou não ser visível.
- Ressuspender o pellet celular em 1 mL de meio Adv. DMEM/F12 e contar o número de células viáveis usando Azul de Tripano e um hemocitômetro.
- Pellet as células novamente através de centrifugação a 1400 x g por 4 min a 4 °C e remover o sobrenadante.
NOTA: A Figura 1 apresenta uma representação esquemática do processo de isolamento de células isoladas do tecido da biópsia.
3. Incorporação de células únicas em uma "cúpula" de matriz de membrana basal
- Com base no número contado de células viáveis, calcular o volume de matriz da membrana basal necessário para atingir uma concentração final de 10a 5 células viáveis por 50 μL de matriz da membrana basal.
- Execute o seguinte rapidamente para evitar que a matriz da membrana basal se polimerize antes do revestimento. Remova a matriz da membrana basal descongelada do gelo, adicione o volume previamente calculado da matriz da membrana basal às células e misture suavemente pipetando para cima e para baixo por aproximadamente 10 s.
NOTA: É crucial evitar a criação de bolhas durante esta etapa. Não diluir a matriz da membrana basal. - Pipetar rapidamente alíquotas de 50 μL da mistura matriz/célula da membrana basal para o centro de poços individuais em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.
- Cubra imediatamente a placa de 24 poços e, em um único movimento suave, vire a placa de cabeça para baixo. Colocar a placa invertida em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C por 35 min para permitir que a matriz da membrana basal se polimerize.
NOTA: A inversão da placa é essencial para evitar que as células afundem no fundo da placa e para permitir que a matriz da membrana basal se polimerize em uma forma de "cúpula" 3D. - Adicione 500 μL de meio organoide gástrico pré-aquecido a cada poço, garantindo que o topo de cada "cúpula" esteja totalmente submerso no meio. Distribua a mídia ao lado de cada poço para não perturbar a "cúpula".
- Troque a mídia a cada 2-3 dias.
4. Passagem rotineira de organoides via fragmentação
- Uma vez que os organoides estão prontos para a passagem, remova a mídia de cada poço designado.
NOTA: Para determinar o tempo apropriado para a passagem, consulte a seção Resultados Representativos. - Dispense 1 mL de mídia Adv. DMEM/F12 gelada diretamente em uma "cúpula" de matriz de membrana basal. Isso deve iniciar prontamente o rompimento da "cúpula". Continue aspirando e dispensando até que todos os fragmentos da "cúpula" se desprenda da placa.
- Transporte tanto o meio quanto a matriz fragmentada da membrana basal para o próximo poço, repetindo esse processo para todos os poços programados para passagem. Após a desmontagem da "cúpula" final da matriz da membrana basal, dispense o meio e a mistura de organoides e matriz da membrana basal em um tubo de 1,5 mL.
- Anexe uma ponta de 1000 μL a uma pipeta P1000 e, em seguida, insira essa ponta em uma ponta de 200 μL. Isso criará uma ponta de pipeta com um diâmetro pequeno o suficiente para fragmentar os organoides, permitindo ainda a aspiração de um volume maior.
- Pipetar vigorosamente a mistura de organoides e matriz de membrana basal para cima e para baixo aproximadamente 25 vezes para fragmentar os organoides em pequenos pedaços.
- Centrifugar a mistura organoide fragmentada utilizando uma centrífuga de mesa a 4 °C durante 30 s a 2000 x g. Isso resultará em uma pelota de organoides fragmentados separados da matriz e do meio da membrana basal. Utilizar pipeta para aspirar o sobrenadante da matriz da membrana basal e média. Não use vácuo para aspirar o sobrenadante, pois o pellet está solto.
- Calcular o volume de matriz de membrana basal recém-descongelada necessário para que o número de poços/cúpulas seja dividido em uma proporção de 1:2 (50 μL/cúpula). Adicione a matriz de membrana basal fresca e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar, tomando cuidado para evitar a criação de bolhas.
- Alicote rapidamente 50 μL da mistura de fragmentos organoides e matriz da membrana basal em poços individuais de uma placa de 24 poços.
- Tampe a placa, vire-a de cabeça para baixo e coloque-a em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C por 35 minutos para permitir que a matriz da membrana basal se polimerize.
- Adicionar 500 μL de meio organoide gástrico pré-aquecido a cada poço.
NOTA: A Figura 2 apresenta uma visão geral esquemática da passagem de organoides gástricos derivados do paciente através da fragmentação.
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Resultados
Os resultados representativos subsequentes são derivados de biópsias retiradas do epitélio benigno das regiões do corpo gástrico e antro gástrico dos estômagos de cinco pacientes diferentes submetidos à endoscopia digestiva alta. Duas a quatro "cúpulas"/poços foram plaqueadas e analisadas por paciente para biópsias do corpo gástrico e do antro. Organoides foram gerados com sucesso a partir do corpo gástrico e tecido de biópsia do antro gástrico de todos os cinco pacientes. Em média, 41 organoides foram analisados por "cú...
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Discussão
Neste trabalho, um protocolo detalhado para a geração confiável de organoides gástricos humanos a partir de células isoladas isoladas de biópsias de epitélio benigno do corpo gástrico e antro é delineado. As etapas críticas do protocolo giram em torno do tempo, bem como do manuseio da matriz da membrana basal. Para preservar a viabilidade, é essencial iniciar o protocolo o mais rápido possível após a aquisição do tecido da biópsia. O objetivo é começar a digerir o tecido da biópsia dentro de 30 minutos após a biópsia ser...
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Divulgações
Os autores não têm divulgações relevantes.
Agradecimentos
Medicina Genômica da Universidade da Pensilvânia T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & Programa BRCA no Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R & D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Anfotericina B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Ditiotreitol (DTT) | EMSCO / Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicina | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Linha Celular | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazol | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Suplemento | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Estreptococo de caneta | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Espondina ELISA Kit | R & D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R& D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Referências
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359(2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255(2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519(2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151(2023).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
