सौम्य गैस्ट्रिक बॉडी और एंट्रल एपिथेलियम की बायोप्सी से रोगी-व्युत्पन्न गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड की स्थापना और लक्षण वर्णन
Summary
गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड अनुसंधान में बढ़ते उपयोग को पाते हैं, फिर भी मानकीकृत सीडिंग घनत्व के साथ एकल-कोशिका डाइजेस्ट से मानव गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए औपचारिक प्रोटोकॉल की कमी है। यह प्रोटोकॉल ऊपरी एंडोस्कोपी के दौरान प्राप्त बायोप्सी ऊतक से गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड को मज़बूती से बनाने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
गैस्ट्रिक रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (पीडीओ) गैस्ट्रिक जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करते हैं। नतीजतन, इन पीडीओ अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में बढ़ते उपयोग पाते हैं। हालांकि, प्रकाशित दृष्टिकोण की कमी एक मानकीकृत प्रारंभिक सेल बोया घनत्व को बनाए रखते हुए एकल सेल डाइजेस्ट से गैस्ट्रिक पीडीओ के उत्पादन के लिए मौजूद है. इस प्रोटोकॉल में, पृथक एकल कोशिकाओं से गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड की दीक्षा और विखंडन के माध्यम से ऑर्गेनोइड को पारित करने के लिए एक विधि के प्रावधान पर जोर दिया गया है। महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल दर्शाता है कि प्रारंभिक सेल बोने घनत्व के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण लगातार सौम्य बायोप्सी ऊतक से गैस्ट्रिक organoids पैदावार और organoid विकास के मानकीकृत मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. अंत में, सबूत उपन्यास अवलोकन का समर्थन करते हैं कि गैस्ट्रिक पीडीओ गठन और विकास की अलग-अलग दरों को प्रदर्शित करते हैं कि क्या ऑर्गेनोइड शरीर की बायोप्सी या पेट के एंट्रल क्षेत्रों से उत्पन्न होते हैं। विशेष रूप से, यह पता चला है कि ऑर्गेनॉइड दीक्षा के लिए एंट्रल बायोप्सी ऊतक के उपयोग के परिणामस्वरूप गैस्ट्रिक बॉडी की बायोप्सी से उत्पन्न ऑर्गेनोइड की तुलना में 20 दिनों की अवधि में अधिक संख्या में ऑर्गेनोइड का गठन होता है और अधिक तेजी से ऑर्गेनॉइड विकास होता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को गैस्ट्रिक पीडीओ के साथ सफलतापूर्वक उत्पन्न करने और काम करने के लिए एक समय पर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीका प्रदान करता है।
Introduction
ऑर्गेनोइड लघु त्रि-आयामी (3 डी) सेलुलर संरचनाएं हैं जो उन अंगों की वास्तुकला और कार्यक्षमता से मिलती जुलती हैं जिनसे वे 1,2 प्राप्त हुए थे। इन प्रयोगशाला विकसित मॉडल एक नियंत्रित वातावरण में स्टेम कोशिकाओं या ऊतक-विशिष्ट कोशिकाओं की खेती करके बनाए जाते हैं जो इन कोशिकाओं को विभिन्न सेल प्रकारों 1,2,3में आत्म-व्यवस्थित और अंतर करने की अनुमति देता है। ऑर्गेनोइड के प्रमुख लाभों में से एक पारंपरिक द्वि-आयामी (2 डी) सेल संस्कृतियों 1,2,3 की तुलना में मानव जीव विज्ञान को अधिक बारीकी से पुन: व्यवस्थित करने की उनकी क्षमता है। विशेष रूप से, मानव ऑर्गेनोइड को उनके मूल 3,4,5 के ऊतक की आनुवंशिक विविधता को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। ऑर्गेनोइड मानव अंग विकास, मॉडल रोगों का अध्ययन करने और नियंत्रित प्रयोगशाला सेटिंग में संभावित चिकित्सा विज्ञान का परीक्षण करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड व्यक्तिगत रोगी के नमूनों से प्राप्त किए जा सकते हैं, व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण और व्यक्तिगत उपचार 3,6,7 के संभावित विकास को सक्षम करते हैं।
शोधकर्ताओं ने गैस्ट्रिक जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए मानव गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड का उपयोग किया है। प्रमुख उदाहरणों में गैस्ट्रिक कैंसर कीमोथेरेपी प्रतिक्रियाओं 8,9,10 की भविष्यवाणी करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (पीडीओ) का उपयोग शामिल है और हेलिकोबैक्टर पाइलोरी संक्रमण 11,12,13के लिए उपकला प्रतिक्रिया का मॉडल है। मानव गैस्ट्रिक organoids गर्दन कोशिकाओं, गड्ढे कोशिकाओं, और अन्य सहायक कोशिकाओं11,14 सहित पेट में पाया विभिन्न सेल प्रकार के होते हैं. गैस्ट्रिक organoids या तो प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (IPSC) या स्टेम कोशिकाओं सीधे बायोप्सी के माध्यम से या गैस्ट्रिक लकीर नमूनों11,14 के माध्यम से प्राप्त गैस्ट्रिक ऊतक से अलग से उत्पन्न किया जा सकता है. गैस्ट्रिक ऊतक से गैस्ट्रिक स्टेम कोशिकाओं का अलगाव आमतौर पर गैस्ट्रिक ग्रंथियों को अलग करने और संवर्धन या एंजाइमेटिक रूप से एकल कोशिकाओं 9,13,15 को मुक्त करने के लिए ऊतक के नमूनों को पचाने के द्वारा किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, इन तकनीकों में से किसी एक का उपयोग कर उत्पन्न गैस्ट्रिक organoids के भीतर कोशिकाओं के भेदभाव समान13 होना दिखाया गया है. इस के साथ वर्णित प्रोटोकॉल एक एकल कोशिका डाइजेस्ट पर केंद्रित है.
ऑर्गेनोइड एक वैज्ञानिक नवाचार का प्रतिनिधित्व करते हैं जो पारंपरिक सेल संस्कृति और पूरे अंगों के बीच की खाई को पाटता है। जैसे-जैसे क्षेत्र में अनुसंधान प्रगति जारी है, ऑर्गेनोइड अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अधिक प्रभावी उपचार और उपचार के विकास में योगदान करने के लिए तैयार हैं। गैस्ट्रिक पीडीओ के बढ़ते उपयोग को देखते हुए, उनकी पीढ़ी के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण की समय पर आवश्यकता है। यहां, ऊपरी एंडोस्कोपी के दौरान अधिग्रहित सौम्य गैस्ट्रिक बायोप्सी ऊतक से अलग एकल कोशिकाओं से मानव गैस्ट्रिक पीडीओ उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से और विशिष्ट रूप से, एकल कोशिकाओं की एक मानकीकृत संख्या को गैस्ट्रिक पीडीओ को मज़बूती से उत्पन्न करने और बाद के लक्षण वर्णन की अनुमति देने के लिए सीडिंग के लिए निर्धारित किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, गैस्ट्रिक बॉडी या गैस्ट्रिक एंट्रम की बायोप्सी से उत्पन्न ऑर्गेनोइड के गठन और विकास में विश्वसनीय अंतर प्रदर्शित किए जाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इसमें, गैस्ट्रिक बॉडी और एंट्रम से सौम्य उपकला की बायोप्सी से अलग एकल कोशिकाओं से मानव गैस्ट्रिक ऑर्गेनोइड को मज़बूती से उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल रेखांकित किया गया है। प्रोटोकॉल में ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यूनिवर्सिटी ऑफ पेंसिल्वेनिया जीनोमिक मेडिसिन T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK) के लिए Basser Center में पुरुष और BRCA कार्यक्रम।
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
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