إنشاء وتوصيف عضويات المعدة المشتقة من المريض من خزعات جسم المعدة الحميد والظهارة الغارية
Summary
تجد العضويات المشتقة من مرضى المعدة استخداما متزايدا في البحث ، ومع ذلك لا توجد بروتوكولات رسمية لتوليد عضويات المعدة البشرية من هضم الخلية الواحدة بكثافة بذر موحدة. يقدم هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإنشاء عضويات معدية موثوقة من أنسجة الخزعة التي تم الحصول عليها أثناء التنظير العلوي.
Abstract
تقدم المواد العضوية المشتقة من مريض المعدة (PDOs) أداة فريدة لدراسة بيولوجيا المعدة وعلم الأمراض. وبالتالي ، تجد PDOs هذه استخداما متزايدا في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية. ومع ذلك ، يوجد نقص في الأساليب المنشورة لإنتاج PDOs المعدة من هضم خلية واحدة مع الحفاظ على كثافة أولية موحدة لبذر الخلية. في هذا البروتوكول ، ينصب التركيز على بدء عضويات المعدة من الخلايا المفردة المعزولة وتوفير طريقة لتمرير الكائنات العضوية من خلال التجزئة. الأهم من ذلك ، يوضح البروتوكول أن النهج الموحد لكثافة بذر الخلايا الأولية ينتج باستمرار عضويات معدية من أنسجة الخزعة الحميدة ويسمح بالقياس الكمي الموحد لنمو الأعضاء. أخيرا ، تدعم الأدلة الملاحظة الجديدة القائلة بأن PDOs في المعدة تظهر معدلات متفاوتة من التكوين والنمو بناء على ما إذا كانت الكائنات العضوية تنشأ من خزعات الجسم أو المناطق الغارية في المعدة. على وجه التحديد ، تم الكشف عن أن استخدام أنسجة الخزعة الغارية لبدء العضوية يؤدي إلى تكوين عدد أكبر من الكائنات العضوية ونمو عضوي أسرع على مدى فترة 20 يوما مقارنة بالمواد العضوية الناتجة عن خزعات جسم المعدة. يوفر البروتوكول الموصوف هنا للمحققين طريقة قابلة للتكرار وفي الوقت المناسب لتوليد PDOs المعدة والعمل معها بنجاح.
Introduction
Organoids هي هياكل خلوية مصغرة ثلاثية الأبعاد (3D) تشبه بنية ووظائف الأعضاء التي اشتقت منها 1,2. يتم إنشاء هذه النماذج المزروعة في المختبر عن طريق زراعة الخلايا الجذعية أو الخلايا الخاصة بالأنسجة في بيئة خاضعة للرقابة تسمح لهذه الخلايا بالتنظيم الذاتي والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا1،2،3. واحدة من المزايا الرئيسية للعضويات هي قدرتها على تلخيص البيولوجيا البشرية بشكل أوثق من ثقافات الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D)1،2،3. على وجه الخصوص ، ثبت أن الكائنات العضوية البشرية تحافظ على التنوع الجيني لأنسجتها الأصلية3،4،5. توفر الكائنات العضوية فرصة فريدة لدراسة تطور الأعضاء البشرية ، والأمراض النموذجية ، واختبار العلاجات المحتملة في بيئة معملية خاضعة للرقابة. علاوة على ذلك ، يمكن اشتقاق المواد العضوية من عينات المرضى الفردية ، مما يتيح مناهج الطب الشخصي والتطوير المحتمل للعلاجات الفردية3،6،7.
استخدم الباحثون عضويات المعدة البشرية للتحقيق في جوانب مختلفة من بيولوجيا المعدة وعلم الأمراض. تشمل الأمثلة البارزة استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) للتنبؤ باستجابات العلاج الكيميائي لسرطان المعدة8،9،10 ونمذجة الاستجابة الظهارية لعدوى هيليكوباكتر بيلوري 11،12،13. تتكون عضويات المعدة البشرية من أنواع مختلفة من الخلايا الموجودة في المعدة ، بما في ذلك خلايا الرقبة وخلايا الحفرة والخلايا الداعمة الأخرى11,14. يمكن إنشاء عضويات المعدة إما من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) أو الخلايا الجذعية المعزولة مباشرة من أنسجة المعدة التي تم الحصول عليها عن طريق الخزعات أو من عينات استئصال المعدة11،14. عادة ما يتم عزل الخلايا الجذعية المعدية عن أنسجة المعدة عن طريق عزل وزراعة الغدد المعدية أو هضم عينات الأنسجة إنزيميا لتحرير الخلايا المفردة9،13،15. الأهم من ذلك ، أن تمايز الخلايا داخل عضويات المعدة المتولدة باستخدام أي من هذه التقنيات قد ثبت أنهمماثل 13. يركز البروتوكول الموصوف هنا على هضم خلية واحدة.
تمثل الكائنات العضوية ابتكارا علميا يسد الفجوة بين زراعة الخلايا التقليدية والأعضاء بأكملها. مع استمرار تقدم البحث في هذا المجال ، تستعد الكائنات العضوية للمساهمة في تطوير علاجات وعلاجات أكثر فعالية لمجموعة واسعة من التطبيقات. بالنظر إلى الاستخدام المتزايد ل PDOs المعدة ، هناك حاجة في الوقت المناسب لنهج موحد لتوليدها. هنا ، يتم وصف بروتوكول توليد PDOs المعدة البشرية من الخلايا المفردة المعزولة من أنسجة خزعة المعدة الحميدة المكتسبة أثناء التنظير العلوي. الأهم من ذلك والفريد ، يتم تحديد عدد موحد من الخلايا المفردة للبذر لتوليد PDOs المعدة بشكل موثوق والسماح بالتوصيف اللاحق. باستخدام هذه التقنية ، يتم إظهار اختلافات موثوقة في تكوين ونمو المواد العضوية الناتجة عن خزعات جسم المعدة أو غار المعدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم تحديد بروتوكول مفصل لتوليد عضويات المعدة البشرية بشكل موثوق من خلايا مفردة معزولة من خزعات ظهارة حميدة من جسم المعدة والغار. تدور الخطوات الحاسمة في البروتوكول حول التوقيت وكذلك التعامل مع مصفوفة الغشاء القاعدي. للحفاظ على الجدوى ، من الضروري بدء البروتوكول في أقرب وقت ممكن بعد …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
جامعة بنسلفانيا الطب الجينومي T32 HG009495 (KHB) ، NCI R21 CA267949 (BWK) ، برنامج الرجال و BRCA في مركز باسر ل BRCA (KHB ، BWK) ، جائزة منحة مؤسسة عائلة DeGregorio (BWK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Referências
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
