Etablissement et caractérisation d’organoïdes gastriques dérivés de patients à partir de biopsies d’épithélium gastrique bénin et d’épithélium antral
Summary
Les organoïdes dérivés de patients gastriques sont de plus en plus utilisés dans la recherche, mais il n’existe pas de protocoles formels pour générer des organoïdes gastriques humains à partir de digestats unicellulaires avec une densité d’ensemencement standardisée. Ce protocole présente une méthode détaillée pour créer de manière fiable des organoïdes gastriques à partir de tissus de biopsie obtenus lors de l’endoscopie haute.
Abstract
Les organoïdes gastriques dérivés de patients (PDO) offrent un outil unique pour l’étude de la biologie et de la pathologie gastriques. Par conséquent, ces PDO sont de plus en plus utilisés dans un large éventail d’applications de recherche. Cependant, il existe une pénurie d’approches publiées pour produire des AOP gastriques à partir de digestats unicellulaires tout en maintenant une densité d’ensemencement cellulaire initiale standardisée. Dans ce protocole, l’accent est mis sur l’initiation d’organoïdes gastriques à partir de cellules isolées et sur la mise au point d’une méthode de transmission d’organoïdes par fragmentation. Il est important de noter que le protocole démontre qu’une approche standardisée de la densité d’ensemencement cellulaire initiale permet d’obtenir systématiquement des organoïdes gastriques à partir de tissus de biopsie bénins et permet une quantification standardisée de la croissance des organoïdes. Enfin, les preuves soutiennent la nouvelle observation selon laquelle les AOP gastriques présentent des taux de formation et de croissance variables selon que les organoïdes proviennent de biopsies du corps ou de régions antrales de l’estomac. Plus précisément, il est révélé que l’utilisation de tissu de biopsie antrale pour l’initiation des organoïdes entraîne la formation d’un plus grand nombre d’organoïdes et une croissance plus rapide des organoïdes sur une période de 20 jours par rapport aux organoïdes générés à partir de biopsies du corps gastrique. Le protocole décrit dans le présent document offre aux chercheurs une méthode opportune et reproductible pour générer et travailler avec succès des AOP gastriques.
Introduction
Les organoïdes sont des structures cellulaires tridimensionnelles miniatures (3D) qui ressemblent à l’architecture et à la fonctionnalité des organes dont ils sont issus 1,2. Ces modèles cultivés en laboratoire sont créés en cultivant des cellules souches ou des cellules tissulaires spécifiques dans un environnement contrôlé qui permet à ces cellules de s’auto-organiser et de se différencier en différents types cellulaires 1,2,3. L’un des principaux avantages des organoïdes est leur capacité à récapituler la biologie humaine de plus près que les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) traditionnelles 1,2,3. En particulier, il a été démontré que les organoïdes humains maintiennent la diversité génétique de leurs tissus d’origine 3,4,5. Les organoïdes offrent une occasion unique d’étudier le développement des organes humains, de modéliser des maladies et de tester des thérapies potentielles dans un environnement de laboratoire contrôlé. De plus, les organoïdes peuvent être dérivés d’échantillons individuels de patients, ce qui permet des approches de médecine personnalisée et le développement potentiel de traitements individualisés 3,6,7.
Les chercheurs ont utilisé des organoïdes gastriques humains pour étudier divers aspects de la biologie et de la pathologie gastriques. Parmi les exemples les plus frappants, citons l’utilisation d’organoïdes dérivés du patient (PDO) pour prédire les réponses à la chimiothérapie du cancer gastrique 8,9,10 et modéliser la réponse épithéliale à l’infection à Helicobacter pylori 11,12,13. Les organoïdes gastriques humains sont constitués de divers types de cellules présentes dans l’estomac, notamment les cellules du cou, les cellules de la fosse et d’autres cellules de soutien11,14. Les organoïdes gastriques peuvent être générés soit à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi), soit à partir de cellules souches directement isolées à partir de tissus gastriques obtenus par biopsies ou à partir d’échantillons de résection gastrique11,14. L’isolement des cellules souches gastriques du tissu gastrique se fait généralement en isolant et en cultivant des glandes gastriques ou en digérant enzymatiquement des échantillons de tissus pour libérer des cellules individuelles 9,13,15. Il est important de noter que la différenciation des cellules au sein des organoïdes gastriques générés à l’aide de l’une ou l’autre de ces techniques s’est avérée similaire13. Le protocole décrit ici se concentre sur un condensé unicellulaire.
Les organoïdes représentent une innovation scientifique qui comble le fossé entre la culture cellulaire traditionnelle et les organes entiers. Alors que la recherche dans le domaine continue de progresser, les organoïdes sont sur le point de contribuer au développement de traitements et de thérapies plus efficaces pour un large éventail d’applications. Compte tenu de l’utilisation croissante des AOP gastriques, il est nécessaire d’adopter une approche standardisée de leur génération. Ici, le protocole de génération de PDO gastriques humaines à partir de cellules uniques isolées à partir de tissus de biopsie gastrique bénigne acquis lors de l’endoscopie haute est décrit. Il est important de noter qu’un nombre normalisé de cellules individuelles est déterminé pour l’ensemencement afin de générer de manière fiable des AOP gastriques et de permettre une caractérisation ultérieure. À l’aide de cette technique, des différences fiables dans la formation et la croissance des organoïdes générés à partir de biopsies du corps gastrique ou de l’antre gastrique sont démontrées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce document, un protocole détaillé pour générer de manière fiable des organoïdes gastriques humains à partir de cellules uniques isolées à partir de biopsies d’épithélium bénin du corps gastrique et de l’antre est décrit. Les étapes critiques du protocole tournent autour de la synchronisation ainsi que de la manipulation de la matrice de la membrane basale. Pour préserver la viabilité, il est essentiel d’initier le protocole le plus tôt possible après l’acquisition du tissu de biopsie. L’…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Médecine génomique de l’Université de Pennsylvanie T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), programme Men & BRCA au Basser Center for BRCA (KHB, BWK), bourse de la Fondation de la famille DeGregorio (BWK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Referências
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