Estabelecimento e Caracterização de Organoides Gástricos Derivados de Pacientes a partir de Biópsias do Corpo Gástrico Benigno e Epitélio Antral
Summary
Organoides gástricos derivados de pacientes encontram uso crescente em pesquisas, mas faltam protocolos formais para gerar organoides gástricos humanos a partir de digestores unicelulares com densidade de semeadura padronizada. Este protocolo apresenta um método detalhado para a criação confiável de organoides gástricos a partir de tecido de biópsia obtido durante a endoscopia digestiva alta.
Abstract
Os organoides derivados do paciente gástrico (DOPs) oferecem uma ferramenta única para o estudo da biologia e patologia gástrica. Consequentemente, essas DOPs encontram uso crescente em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. No entanto, existe uma escassez de abordagens publicadas para produzir PDOs gástricas a partir de digeridos de célula única, mantendo uma densidade de semeadura celular inicial padronizada. Neste protocolo, a ênfase está na iniciação de organoides gástricos a partir de células isoladas isoladas e no fornecimento de um método para passar organoides através da fragmentação. É importante ressaltar que o protocolo demonstra que uma abordagem padronizada para a densidade inicial de semeadura celular produz organoides gástricos a partir de tecido benigno de biópsia e permite a quantificação padronizada do crescimento organoide. Finalmente, as evidências apoiam a nova observação de que as DOPs gástricas exibem taxas variáveis de formação e crescimento com base no fato de os organoides se originarem de biópsias do corpo ou de regiões antrais do estômago. Especificamente, revela-se que o uso de tecido de biópsia antral para iniciação organoide resulta em maior número de organoides formados e crescimento organoide mais rápido durante um período de 20 dias quando comparado aos organoides gerados a partir de biópsias do corpo gástrico. O protocolo aqui descrito oferece aos investigadores um método oportuno e reprodutível para gerar e trabalhar com sucesso com DOPs gástricas.
Introduction
Os organoides são estruturas celulares tridimensionais (3D) em miniatura que se assemelham à arquitetura e funcionalidade dos órgãos dos quais foram derivadas 1,2. Esses modelos cultivados em laboratório são criados a partir do cultivo de células-tronco ou células tecido-específicas em um ambiente controlado que permite que essas células se auto-organizem e se diferenciem em vários tipos celulares 1,2,3. Uma das principais vantagens dos organoides é sua capacidade de recapitular a biologia humana mais de perto do que as culturas tradicionais de células bidimensionais (2D) 1,2,3. Em particular, organoides humanos têm demonstrado manter a diversidade genética de seu tecido de origem 3,4,5. Os organoides oferecem uma oportunidade única para estudar o desenvolvimento de órgãos humanos, modelar doenças e testar potenciais terapêuticas em um ambiente laboratorial controlado. Além disso, os organoides podem ser derivados de amostras individuais de pacientes, possibilitando abordagens de medicina personalizada e o potencial desenvolvimento de tratamentos individualizados 3,6,7.
Pesquisadores têm usado organoides gástricos humanos para investigar vários aspectos da biologia e patologia gástrica. Exemplos proeminentes incluem o uso de organoides derivados do paciente (DOPs) para predizer respostas à quimioterapia do câncer gástrico 8,9,10 e modelar a resposta epitelial à infecção pelo Helicobacter pylori 11,12,13. Os organoides gástricos humanos consistem em vários tipos celulares encontrados no estômago, incluindo células do pescoço, células da fossa e outras células de suporte11,14. Os organoides gástricos podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ou células-tronco diretamente isoladas do tecido gástrico obtido por biópsias ou de espécimes de ressecção gástrica11,14. O isolamento de células-tronco gástricas do tecido gástrico é comumente feito por meio do isolamento e cultura de glândulas gástricas ou digestão enzimática de amostras de tecido para liberação de células isoladas 9,13,15. É importante ressaltar que a diferenciação de células dentro de organoides gástricos gerados por qualquer uma dessas técnicas tem se mostrado semelhante13. O protocolo aqui descrito concentra-se em um digesto unicelular.
Os organoides representam uma inovação científica que faz a ponte entre a cultura celular tradicional e órgãos inteiros. À medida que a pesquisa no campo continua a progredir, os organoides estão prontos para contribuir para o desenvolvimento de tratamentos e terapias mais eficazes para uma ampla gama de aplicações. Dada a crescente utilização de DOPs gástricas, há uma necessidade oportuna de uma abordagem padronizada para sua geração. Aqui é descrito o protocolo para geração de DOPs gástricas humanas a partir de células isoladas de tecido de biópsia gástrica benigna adquirida durante endoscopia digestiva alta. Importante e singularmente, um número padronizado de células únicas é determinado para semeadura para gerar PDOs gástricas de forma confiável e permitir a caracterização subsequente. Usando esta técnica, diferenças confiáveis na formação e crescimento de organoides gerados a partir de biópsias do corpo gástrico ou antro gástrico são demonstradas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, um protocolo detalhado para a geração confiável de organoides gástricos humanos a partir de células isoladas isoladas de biópsias de epitélio benigno do corpo gástrico e antro é delineado. As etapas críticas do protocolo giram em torno do tempo, bem como do manuseio da matriz da membrana basal. Para preservar a viabilidade, é essencial iniciar o protocolo o mais rápido possível após a aquisição do tecido da biópsia. O objetivo é começar a digerir o tecido da biópsia dentro de 30 minuto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Medicina Genômica da Universidade da Pensilvânia T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & Programa BRCA no Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
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