Установление и характеристика органоидов желудка, полученных от пациентов, из биопсии доброкачественного тела желудка и антрального эпителия
Summary
Органоиды, полученные от желудочных пациентов, находят все большее применение в исследованиях, однако формальные протоколы получения органоидов желудка человека из одноклеточных пищеварителей со стандартизированной плотностью посева отсутствуют. В данном протоколе представлен подробный метод надежного создания органоидов желудка из биопсийной ткани, полученной при эндоскопии верхних отделов желудка.
Abstract
Органоиды, полученные от пациентов желудка (PDOs), предлагают уникальный инструмент для изучения биологии и патологии желудка. Следовательно, эти PDO находят все большее применение в широком спектре исследовательских приложений. Тем не менее, существует нехватка опубликованных подходов к получению желудочных ЗОП из одноклеточных дигестов при сохранении стандартизированной начальной плотности посева клеток. В этом протоколе акцент делается на инициации желудочных органоидов из изолированных единичных клеток и предоставлении метода пассации органоидов путем фрагментации. Важно отметить, что протокол демонстрирует, что стандартизированный подход к начальной плотности посева клеток последовательно дает органоиды желудка из доброкачественной биопсийной ткани и позволяет стандартизировать количественную оценку роста органоидов. Наконец, фактические данные подтверждают новое наблюдение о том, что желудочные ЗОП демонстрируют различную скорость образования и роста в зависимости от того, происходят ли органоиды из биопсии тела или антральных областей желудка. В частности, выявлено, что использование ткани антральной биопсии для инициации органоидов приводит к образованию большего количества органоидов и более быстрому росту органоидов в течение 20-дневного периода по сравнению с органоидами, полученными из биопсии тела желудка. Протокол, описанный в настоящем документе, предлагает исследователям своевременный и воспроизводимый метод успешного создания и работы с желудочными ЗОП.
Introduction
Органоиды представляют собой миниатюрные трехмерные (3D) клеточные структуры, которые напоминают архитектуру и функциональность органов, из которых они были получены 1,2. Эти выращенные в лаборатории модели создаются путем культивирования стволовых клеток или тканеспецифичных клеток в контролируемой среде, которая позволяет этим клеткам самоорганизовываться и дифференцироваться в различные типы клеток 1,2,3. Одним из ключевых преимуществ органоидов является их способность более точно повторять биологию человека, чем традиционные двумерные (2D) клеточные культуры 1,2,3. В частности, было показано, что органоиды человека сохраняют генетическое разнообразие тканей своего происхождения 3,4,5. Органоиды дают уникальную возможность изучать развитие органов человека, моделировать заболевания и тестировать потенциальные терапевтические средства в контролируемых лабораторных условиях. Кроме того, органоиды могут быть получены из индивидуальных образцов пациентов, что позволяет применять персонализированные подходы к медицине и потенциальную разработку индивидуализированных методов лечения 3,6,7.
Исследователи использовали органоиды желудка человека для изучения различных аспектов биологии и патологии желудка. Яркими примерами являются использование органоидов, полученных от пациентов (PDO), для прогнозирования ответов на химиотерапию рака желудка 8,9,10 и моделирования эпителиального ответа на инфекцию Helicobacter pylori 11,12,13. Органоиды желудка человека состоят из различных типов клеток, обнаруженных в желудке, включая клетки шеи, клетки ямки и другие поддерживающие клетки11,14. Органоиды желудка могут быть получены либо из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), либо из стволовых клеток, непосредственно выделенных из ткани желудка, полученной с помощью биопсии, или из образцов резекции желудка11,14. Выделение желудочных стволовых клеток из желудочной ткани обычно осуществляется путем изоляции и культивирования желудочных желез или ферментативного расщепления образцов тканей для высвобождения отдельных клеток 9,13,15. Важно отметить, что дифференцировка клеток в органоидах желудка, полученных с помощью любого из этих методов, была аналогичной13. Протокол, описанный здесь, основан на дайджесте с одной клеткой.
Органоиды представляют собой научную инновацию, которая устраняет разрыв между традиционной клеточной культурой и целыми органами. По мере того, как исследования в этой области продолжают прогрессировать, органоиды готовы внести свой вклад в разработку более эффективных методов лечения и терапии для широкого спектра применений. Учитывая растущее использование желудочных ЗОП, существует острая необходимость в стандартизированном подходе к их созданию. Описан протокол получения ЗОП желудка человека из единичных клеток, выделенных из доброкачественной биопсийной ткани желудка, полученной при эндоскопии верхних отделов желудка. Важно и уникально то, что для посева определяется стандартизированное количество отдельных клеток, чтобы надежно генерировать желудочные ЗОП и позволять впоследствии характеризовать. С помощью этого метода продемонстрированы достоверные различия в образовании и росте органоидов, полученных при биопсии тела желудка или антрального слоя желудка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изложен подробный протокол достоверной генерации органоидов желудка человека из единичных клеток, выделенных из биоптатов доброкачественного эпителия из тела желудка и антрума. Важнейшие этапы протокола связаны с синхронизацией, а также с обработкой матрицы базальной мембраны. Для ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Университет Пенсильвании по геномной медицине T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), программа Men & BRCA в Центре Бассера для BRCA (KHB, BWK), грант Фонда семьи ДеГрегорио (BWK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Referências
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
