Mide hastası kaynaklı organoidler araştırmalarda giderek artan bir kullanım alanı bulmaktadır, ancak standartlaştırılmış tohumlama yoğunluğuna sahip tek hücreli sindirimlerden insan mide organoidleri üretmek için resmi protokoller eksiktir. Bu protokol, üst endoskopi sırasında elde edilen biyopsi dokusundan gastrik organoidlerin güvenilir bir şekilde oluşturulması için ayrıntılı bir yöntem sunar.
Mide hastası kaynaklı organoidler (PDO’lar), mide biyolojisi ve patolojisini incelemek için benzersiz bir araç sunar. Sonuç olarak, bu PDO’lar çok çeşitli araştırma uygulamalarında artan bir kullanım alanı bulmaktadır. Bununla birlikte, standartlaştırılmış bir başlangıç hücre tohumlama yoğunluğunu korurken, tek hücreli sindirimlerden gastrik PDO’lar üretmek için yayınlanmış yaklaşımların eksikliği vardır. Bu protokolde, izole edilmiş tek hücrelerden mide organoidlerinin başlatılması ve organoidlerin parçalanma yoluyla geçirilmesi için bir yöntemin sağlanması üzerinde durulmaktadır. Daha da önemlisi, protokol, ilk hücre tohumlama yoğunluğuna standartlaştırılmış bir yaklaşımın, iyi huylu biyopsi dokusundan tutarlı bir şekilde gastrik organoidler verdiğini ve organoid büyümesinin standartlaştırılmış nicelleştirilmesine izin verdiğini göstermektedir. Son olarak, kanıtlar, gastrik PDO’ların, organoidlerin vücudun biyopsilerinden mi yoksa midenin antral bölgelerinden mi kaynaklandığına bağlı olarak değişen oluşum ve büyüme oranları gösterdiğine dair yeni gözlemi desteklemektedir. Spesifik olarak, organoid başlatma için antral biyopsi dokusunun kullanılmasının, mide gövdesinin biyopsilerinden üretilen organoidlere kıyasla 20 günlük bir süre boyunca daha fazla sayıda organoid oluşumu ve daha hızlı organoid büyümesi ile sonuçlandığı ortaya konmuştur. Burada açıklanan protokol, araştırmacılara gastrik PDO’ları başarılı bir şekilde oluşturmak ve bunlarla çalışmak için zamanında ve tekrarlanabilir bir yöntem sunar.
Organoidler, türetildikleri organların mimarisine ve işlevselliğine benzeyen minyatür üç boyutlu (3D) hücresel yapılardır 1,2. Laboratuvarda yetiştirilen bu modeller, kök hücrelerin veya dokuya özgü hücrelerin, bu hücrelerin kendi kendini organize etmesine ve çeşitli hücre tiplerine farklılaşmasına izin veren kontrollü bir ortamda yetiştirilmesiyle oluşturulur 1,2,3. Organoidlerin en önemli avantajlarından biri, insan biyolojisini geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürlerindendaha yakından özetleme yetenekleridir 1,2,3. Özellikle, insan organoidlerinin orijin dokularının genetik çeşitliliğini koruduğu gösterilmiştir 3,4,5. Organoidler, kontrollü bir laboratuvar ortamında insan organı gelişimini incelemek, hastalıkları modellemek ve potansiyel terapötikleri test etmek için eşsiz bir fırsat sunar. Ayrıca, organoidler bireysel hasta örneklerinden elde edilebilir, bu da kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımlarına ve bireyselleştirilmiş tedavilerin potansiyel olarak geliştirilmesine olanak tanır 3,6,7.
Araştırmacılar, mide biyolojisi ve patolojisinin çeşitli yönlerini araştırmak için insan mide organoidlerini kullandılar. Öne çıkan örnekler arasında mide kanseri kemoterapi yanıtlarınıtahmin etmek için hasta kaynaklı organoidlerin (PDO’lar) kullanımı 8,9,10 ve Helicobacter pylori enfeksiyonunaepitelyal yanıtı modellemek 11,12,13 yer alır. İnsan mide organoidleri, boyun hücreleri, çukur hücreleri ve diğer destekleyici hücreler dahil olmak üzere midede bulunan çeşitli hücre tiplerinden oluşur11,14. Gastrik organoidler, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) veya biyopsiler yoluyla elde edilen mide dokusundan veya gastrik rezeksiyon örneklerinden doğrudan izole edilen kök hücrelerdenüretilebilir 11,14. Mide kök hücrelerinin mide dokusundan izolasyonu yaygın olarak mide bezlerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi veya tek hücreleri serbest bırakmak için doku örneklerinin enzimatik olarak sindirilmesiyle yapılır 9,13,15. Önemli olarak, bu tekniklerden herhangi biri kullanılarak üretilen mide organoidleri içindeki hücrelerin farklılaşmasının benzer olduğu gösterilmiştir13. Burada açıklanan protokol, tek hücreli bir özete odaklanır.
Organoidler, geleneksel hücre kültürü ile tüm organlar arasındaki boşluğu dolduran bilimsel bir yeniliği temsil eder. Alandaki araştırmalar ilerlemeye devam ettikçe, organoidler çok çeşitli uygulamalar için daha etkili tedavilerin ve terapilerin geliştirilmesine katkıda bulunmaya hazırdır. Gastrik PDO’ların artan kullanımı göz önüne alındığında, bunların üretilmesi için standart bir yaklaşıma zamanında ihtiyaç vardır. Burada, üst endoskopi sırasında elde edilen iyi huylu gastrik biyopsi dokusundan izole edilen tek hücrelerden insan gastrik PDO’larının üretilmesi için protokol açıklanmaktadır. Önemli ve benzersiz bir şekilde, gastrik PDO’ları güvenilir bir şekilde oluşturmak ve sonraki karakterizasyona izin vermek için tohumlama için standartlaştırılmış sayıda tek hücre belirlenir. Bu teknik kullanılarak, mide gövdesi veya mide antrumunun biyopsilerinden üretilen organoidlerin oluşumu ve büyümesinde güvenilir farklılıklar gösterilmiştir.
Burada, mide gövdesinden ve antrumdan iyi huylu epitel biyopsilerinden izole edilen tek hücrelerden insan mide organoidlerini güvenilir bir şekilde üretmek için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir. Protokoldeki kritik adımlar, bazal membran matrisinin ele alınmasının yanı sıra zamanlama etrafında döner. Canlılığı korumak için, biyopsi dokusunu aldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede protokolü başlatmak önemlidir. Amaç, biyopsi yapıldıktan sonraki 30 dakika içinde biyopsi dokusunun s…
The authors have nothing to disclose.
Pennsylvania Üniversitesi Genomik Tıp T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Basser BRCA Merkezi’nde Erkekler ve BRCA Programı (KHB, BWK), DeGregorio Aile Vakfı Hibe Ödülü (BWK).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
BZ-X710 | Keyence | n/a | |
cellSens | Olympus | n/a | |
Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
DPBS | Gibco | 14200-075 | |
Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel | Corning | 47743-715 | |
Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |