Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

Summary

Este protocolo foi desenvolvido para monitorar longitudinalmente as propriedades mecânicas do tecido da placa neural durante a neurulação embrionária de pintinhos. Baseia-se na integração de um microscópio Brillouin e um sistema de incubação no estágio, permitindo imagens mecânicas ao vivo do tecido da placa neural em embriões de pintinhos cultivados ex ovo .

Abstract

O fechamento do tubo neural (NTC) é um processo crítico durante o desenvolvimento embrionário. A falha nesse processo pode levar a defeitos do tubo neural, causando malformações congênitas ou mesmo mortalidade. As NTC envolvem uma série de mecanismos em níveis genéticos, moleculares e mecânicos. Embora a regulação mecânica tenha se tornado um tópico cada vez mais atraente nos últimos anos, ela permanece em grande parte inexplorada devido à falta de tecnologia adequada para a realização de testes mecânicos de tecido embrionário 3D in situ. Em resposta, desenvolvemos um protocolo para quantificar as propriedades mecânicas do tecido embrionário de galinhas de forma não invasiva e sem contato. Isto é conseguido através da integração de um microscópio Brillouin confocal com um sistema de incubação no palco. Para sondar a mecânica dos tecidos, um embrião pré-cultivado é coletado e transferido para uma incubadora no palco para cultura ex ovo . Simultaneamente, as imagens mecânicas do tecido da placa neural são adquiridas pelo microscópio Brillouin em diferentes momentos do desenvolvimento. Este protocolo inclui descrições detalhadas da preparação da amostra, a implementação de experimentos de microscopia de Brillouin e o pós-processamento e análise dos dados. Seguindo esse protocolo, os pesquisadores podem estudar longitudinalmente a evolução mecânica do tecido embrionário durante o desenvolvimento.

Introduction

Os defeitos do tubo neural (DTN) são graves defeitos congênitos do sistema nervoso central causados por falhas no fechamento do tubo neural (NTC) durante o desenvolvimento embrionário¹. A etiologia dos DTNs é complexa. Estudos têm mostrado que as NTC envolvem uma sequência de processos morfogenéticos, incluindo extensão convergente, flexão da placa neural (por exemplo, constrição apical), elevação da prega neural e, finalmente, adesão da prega neural. Esses processos são regulados por múltiplos mecanismos moleculares e genéticos ^2,3, e qualquer mau funcionamento de....

Protocol

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Wayne State University.

1. Preparação experimental

1. Use uma solução de etanol a 70% para limpar e esterilizar a tesoura e pinça. Além disso, prepare pipetas descartáveis e uma seringa.
2. Preparar um meio de lavagem adicionando 3,595 g de NaCl a 495 mL de água deionizada. Em seguida, adicionar 5 ml de Penicilina-Estreptomicina (5 U/mL) ao meio. Encha uma placa de Petri de 100 mm com o meio de lavagem e aqueça-a a 37 °C.
3. Prepare pratos de cultura de acordo com a Figura 1, que ilustra a co....

Results

A Figura 6 mostra o esquema do microscópio Brillouin. O sistema emprega um laser de 660 nm como fonte de luz. Um isolador é colocado logo após a cabeça do laser para rejeitar qualquer luz retro-refletida, e um filtro de densidade neutra (ND) é usado para ajustar a potência do laser. Um par de lentes, L1 e L2, com distâncias focais de f1 = 16 mm e f2 = 100 mm, respectivamente, são usados para expandir o feixe de laser. Uma placa de meia-onda (HWP) e um polarizador linear (Polarizador 1) são e.......

Discussion

O desenvolvimento inicial do embrião pode ser facilmente afetado por distúrbios externos. Portanto, é necessário o máximo de cautela durante a extração e transferência da amostra. Um problema potencial é o descolamento do embrião do papel de filtro, o que pode levar ao encolhimento da membrana vitelínica e resultar em um artefato inclinado da placa neural na imagem de Brillouin. Além disso, esse encolhimento pode interromper o desenvolvimento do embrião. Deve-se prestar atenção a várias etapas críticas para evitar o desc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de Petri de 100 mm	Palco	2D FB0875713
	Prior Scientific	H117E2
35 mm	World Precision Instruments	FD35-100
Microscópio Brillouin com incubadora no palco	N/A	N/A	Este é um sistema de microscópio Brillouin personalizado baseado na Ref. 30
Ovos de galinha	Universidade de Connecticut	N/A
Câmera CMOS	Thorlabs	CS2100M-USB
Câmera EMCCD	Andor	iXon
Etanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Papel de filtro	Whatman	1004-070
Incubadora para cultura in ovo	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Anel	Thorlabs	SM1RR
Corpo do microscópio	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Incubadora no palco	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15070-063
Pipetas	Fisherbrand	13-711-6M
Tesoura	Artman instruments	N/A	3pc Micro Tesoura 5
Seringa	BD	305482
Papel de seda	Kimwipes	N/A
Tubo	Corning	430052
Pinças	DR Instruments	N/A	Conjunto de Pinças de Microdissecção