Et beskyttelsesassay blev udviklet til at overvåge retinal vaskulaturens modstandsdygtighed over for døden fra diabetes / diabetisk retinopati-relaterede fornærmelser såsom oxidativ stress og cytokiner.
Diabetisk retinopati (DR) er en kompleks og progressiv okulær sygdom karakteriseret ved to forskellige faser i dets patogenese. Den første fase involverer tab af beskyttelse mod diabetes-induceret skade på nethinden, mens den anden fase centrerer sig om akkumulering af denne skade. Traditionelle analyser fokuserer primært på evaluering af kapillær degeneration, hvilket er tegn på skadens sværhedsgrad, i det væsentlige rettet mod anden fase af DR. De giver dog kun indirekte indsigt i, om de beskyttende mekanismer i retinal vaskulatur er blevet kompromitteret. For at løse denne begrænsning blev der udviklet en ny tilgang til direkte vurdering af nethindens beskyttelsesmekanismer – specifikt dens modstandsdygtighed over for diabetesinducerede fornærmelser som oxidativ stress og cytokiner. Denne beskyttelsesanalyse, selvom den oprindeligt var designet til diabetisk retinopati, har potentialet til bredere anvendelser i både fysiologiske og patologiske sammenhænge. Sammenfattende indebærer forståelse af patogenesen af diabetisk retinopati at anerkende de to faser af beskyttelsestab og skadeakkumulering, hvor dette innovative beskyttelsesassay tilbyder et værdifuldt værktøj til forskning og potentielt strækker sig til andre medicinske tilstande.
Diabetisk retinopati (DR) er en af de mikrovaskulære komplikationer af diabetes mellitus (DM) og den førende årsag til blindhed hos personer i den erhvervsaktive alder i udviklede lande1. Store risikofaktorer for diabetisk retinopati er varigheden og graden af hyperglykæmi 2,3,4. Mens DM forårsager dysfunktion af både de vaskulære og neurale komponenter i nethinden5, er diagnosen DR baseret på morfologiske træk ved retinal vaskulatur6.
Hyperglykæmi-induceret oxidativt stress er en af drivkræfterne bag DR-patogenese7. Øget oxidativ stress forårsager udbredt skade, hvilket kompromitterer mitokondriernes funktionalitet og derved yderligere øger niveauet af reaktive iltarter. Disse hændelser ledsages af lækage af retinale kar, en stigning i niveauet af inflammatoriske cytokiner og død af både neurale og vaskulære celletyper i nethinden. Tab af vaskulære celler og dermed funktionaliteten af det omfattende kapillærnetværk i nethinden resulterer i hypoxi, en potent stimulus for en række reaktioner5. Sådanne reaktioner omfatter øget ekspression af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), der driver både permeabilitet og angiogenese, kardinale træk ved de avancerede, synstruende stadier af DR – diabetisk makulaødem og proliferativ diabetisk retinopati6.
Visse træk ved DR tyder på, at en organisme (både patienter og forsøgsdyr) har en iboende evne til at modstå denne indikation. Patienter oplever flere årtier med DM, før de udvikler synstruende DR 8,9,10,11,12,13. Mens gnavermodeller af DM ikke udvikler de avancerede, synstruende stadier af DR14, gør den indledende/milde form af DR, der manifesterer sig, det først efter en periode på uger eller måneder påDM 15,16. Desuden er DR progressiv hos både patienter og forsøgsdyr, og retinal dysfunktion / skade øges, når varigheden af DM forlænges. Endelig udvikler nogle patienter med DM aldrig DR. I visse tilfælde skyldes det, at sådanne personer ikke oplever diabetes længe nok til, at DR kan udvikle sig. I andre tilfælde skyldes det, at de udviser ekstraordinær modstand mod DR; som det er tilfældet med deltagere i medaljeundersøgelsen, der ikke udvikler DR efter 50 år eller mere medDM 17. På trods af en sådan overbevisende støtte til eksistensen af beskyttelse mod DR og dens enorme translationelle relevans er mekanismen bag beskyttelse ikke blevet aggressivt undersøgt.
Beskyttelsesanalysen beskrevet heri blev udviklet for at lette undersøgelsen af, hvorfor DR er forsinket fra begyndelsen af DM i diabetiske mus. De vigtigste trin i denne analyse, der anvendes på DM- og ikke-DM-mus, inkluderer (1) levering af en submaksimal dødsfremkaldende fornærmelse mod øjet (ex vivo eller in vivo), (2) isolering af retinal vaskulatur, (3) farvning af vaskulaturen med TUNEL og DAPI, (4) fotografering af de resulterende billeder og kvantificering af procentdelen af TUNEL / DAPI dobbeltpositive arter.
I denne undersøgelse blev der etableret et assay for at detektere resistens / sårbarhed af retinal vaskulatur til døden induceret af DM / DR-relaterede fornærmelser såsom iskæmi / oxidativ stress og cytokiner. Dette manuskript giver en detaljeret beskrivelse af dette assay, som er en modifikation af flere offentliggjorte protokoller 19,20,21.
Protokollen omfatter flere afgørende faser. For det første er det bydende nødvendigt at omhyggeligt dissekere nethinden, sikre bevarelsen af det vaskulære netværk og forhindre betydelige tårer. Dette kan opnås ved at lave et snit 2-3 mm bageste til limbus, da nethinden klæber tæt til ora serrata, og det er udfordrende at adskille det. For det andet skal du belægge alle instrumenter, der kommer i kontakt med karrene (f.eks. Enkelthårsbørster, overførsel af pipet og tang) med trypsin ved at dyppe disse værktøjer i YL-trypsinopløsningen under hele proceduren. Dette forhindrer vaskulaturen i at klæbe til de instrumenter, der anvendes i denne protokol. For det tredje, fordi mikrovaskulaturen er næsten usynlig under normalt lys, kræves øget årvågenhed under snavsaspiration og overførsel til mikroskopets dias for at forhindre utilsigtet tab.
En passende grad af enzymatisk fordøjelse af de forskellige lag af nethinden er afgørende; Utilstrækkelig fordøjelse forhindrer adskillelse af neuronalt væv fra det vaskulære netværk, mens overdreven fordøjelse opløser vaskulær plexus. Forskellige fordøjelsestider fra 1 h19 til natten over 23 er blevet rapporteret. Baseret på observationer giver en fordøjelsestid på 4 timer og 15 minutter de mest gunstige resultater sammenlignet med varigheder på 2 timer, 3 timer og 4 timer. Forlængelse af fordøjelsen ud over dette punkt vil sandsynligvis ikke forbedre processen og kan i stedet kompromittere vaskulaturens integritet.
I tilfælde, hvor den fordøjede nethinden klæber til enkelthårsbørsten, dyppes håret i YL trypsinopløsning flere gange. Dette reducerer børstens klæbrige områder. Hvis hårbørsten stadig klæber til det vaskulære væv, skal du inspicere det for resterende fragmenter af glaslegeme og fjerne dem med tang.
Det optimale tidspunkt for fuldstændig fjernelse af glaslegemet er efter eliminering af fotoreceptorerne, men før fjernelse af det resterende neurale og gliavæv. Nethinden opretholder stivhed, indtil fotoreceptorer fjernes. Ekstraktion af glaslegemet på dette stadium kan potentielt rive nethinden / vaskulaturen. De delikate lag af resterende neurale og gliavæv spiller en afgørende rolle i bevarelsen af den buede form af den vaskulære struktur. De forhindrer nethinden i at rive i midten, når glaslegemet løsnes fra synsnerven.
Hvis den isolerede vaskulatur slet ikke klæber til mikroskopglasset, indikerer det, at den del af diaset, hvor vedhæftning forventes at forekomme, er snavset. Prøv at flytte fartøjerne hen over lysbilledets overflade for at finde et klæbrigt sted, skift til et andet lysbillede eller rengør lysbilledet omhyggeligt, og prøv igen. Hvis karrene holder sig til rutsjebanen, før de folder sig ud i deres skållignende form, skal du løfte vaskulaturen fra rutsjebanen for at lade den flyde frit i vandet igen. Gør dette trin med tang, der gentagne gange er dyppet i YL trypsinopløsningen.
Der er rapporteret om flere alternative teknikker til isolering af vaskulaturen, som ikke ville være egnede til den beskyttelsesanalyse, der er beskrevet heri. For eksempel er osmotisk lysis blevet anvendt til at isolere vaskulaturen fra ikke-fikserede nethindeprøver, hvilket letter biokemiske undersøgelser af vævet24,25. Denne procedure bevarer dog muligvis ikke vaskulaturens anatomi såvel som den tilgang, der anvendes i denne artikel. Tilsvarende, mens vævsprintmetoden til isolering af store segmenter af mikrovaskulatur muliggør analyse af vaskulaturens elektrotoniske arkitektur26, genvindes hele vaskulærsengen typisk ikke.
Denne analyse blev udviklet, fordi eksisterende tilgange til overvågning af kapillær degeneration ikke behandler spørgsmålet om beskyttelse. Kapillær degeneration, som opstår efter langvarig DM, indikerer, om DR har udviklet sig. Ud over at diagnosticere DR er dette resultat nyttigt til at vurdere, om et middel / terapi forhindrer DR. Imidlertid taler eksisterende kapillærdegenerationsassays ikke til agensens underliggende virkningsmekanisme. Et sådant middel kan forhindre patologiske hændelser, der driver DR, såsom øget oxidativ stress eller cytokiner. Alternativt kan midlet håndhæve beskyttelsen ved at øge modstandsdygtigheden over for oxidativt stress og cytokiner og/eller fremme reparation af skader. Dette nye beskyttelsesassay kan bruges til at bestemme, om den gavnlige effekt af en given terapi indebærer håndhævelse af det endogene system, der beskytter mod DM-relateret død.
En ulempe ved denne beskyttelsesanalyse er, at den ikke skelner mellem de to celletyper i retinale kar: endotelceller (EC’er) og pericytter (PC’er). Mens udseendet af deres kerner i PASH-farvede sektioner er celletypespecifikt (figur 6), viser ikke alle kerner diagnostiske funktioner. Ca. 30% af kernerne kan ikke entydigt defineres som EC eller PC, i det mindste delvist, fordi de todimensionale billeder opnået fra PASH-farvede prøver ufuldstændigt løser den tredimensionelle struktur af vaskulær plexus. Denne hindring kunne overvindes ved yderligere analyse såsom immunofluorescerende farvning med celletypespecifikke markører. Sådanne billeder, der adskiller de to celletyper, kunne farves sammen med TUNEL for at bestemme modstanden/sårbarheden af hver af de vaskulære celletyper.
Denne vaskulære analyse giver ingen oplysninger om den neurale nethinden. Der kan udvikles yderligere assays for at tilvejebringe sådanne oplysninger. For eksempel, i stedet for at isolere retinal vaskulatur, kunne en enkelt cellesuspension af hele nethinden genereres og derefter analyseres (ved fluorescerende aktiveret cellesortering) for modstand / sårbarhed. Inkluderingen af celletypespecifikke markører (både neurale og vaskulære) sammen med indikatorer for celledød ville give et mere komplet billede af de retinale celletyper, der har kapacitet til beskyttelse mod DM / DR-medieret død.
Afslutningsvis giver beskyttelsesanalysen beskrevet heri en stærk tilgang til at undersøge den mekanisme, der er ansvarlig for forsinkelsen mellem DM’s begyndelse og manifestationen af DR hos mus.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Illinois Society to Prevent Blindness, National Institute of Health (EY031350 and EY001792) og et ubegrænset tilskud fra Research to Prevent Blindness Foundation.
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
24-well plates | Falcon | 353047 | |
33 G needle | Hamilton | customized | |
Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
Periodic acid | Sigma | 3951 | |
Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
Xylene | Sigma | 65351-M | |
YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |