Dosage immunologique portable sur papier combiné à une application pour smartphone pour la détection colorimétrique et quantitative de l’antigène NS1 de la dengue

Summary

Pour répondre aux besoins urgents de diagnostic de la dengue, nous présentons ici un dispositif d’analyse sur papier Dengue NS1 intégré à une application pour smartphone (DEN-NS1-PAD) pour quantifier la concentration de l’antigène NS1 de la dengue dans les échantillons cliniques de sérum/sang. Cette innovation améliore la gestion de la dengue en aidant à la prise de décision clinique dans divers contextes de soins de santé, même ceux aux ressources limitées.

Abstract

L’infection par le virus de la dengue (DENV), qui est transmise par les moustiques Aedes , est un problème majeur de santé publique dans les pays tropicaux et subtropicaux. Avec une incidence annuelle d’environ 10 millions de cas et 20 000 à 25 000 décès, en particulier chez les enfants, il est urgent de disposer d’outils de diagnostic pratiques. La présence de la protéine non structurelle 1 (NS1) de la dengue au début de l’infection a été liée à la libération de cytokines, aux fuites vasculaires et au dysfonctionnement endothélial, ce qui en fait un marqueur potentiel de la dengue sévère.

Les immunoessais sur papier tels que les tests à flux latéral (LFA) et les dispositifs d’analyse microfluidiques sur papier (PAD) ont gagné en popularité en tant que tests de diagnostic en raison de leur simplicité, de leur rapidité, de leur faible coût, de leur spécificité et de leur facilité d’interprétation. Cependant, les immunotests conventionnels sur papier pour la détection de la dengue NS1 reposent généralement sur une inspection visuelle, ne donnant que des résultats qualitatifs. Pour remédier à cette limitation et améliorer la sensibilité, nous avons proposé un test de détection de la dengue NS1 hautement portable sur un dispositif analytique sur papier (PAD), à savoir DEN-NS1-PAD, qui intègre une application pour smartphone comme lecteur colorimétrique et quantitatif. Le système de développement permet de quantifier directement les concentrations de NS1 dans les échantillons cliniques.

Des échantillons de sérum et de sang prélevés sur les patients ont été utilisés pour démontrer les performances du prototype du système. Les résultats ont été obtenus immédiatement et peuvent être utilisés pour une évaluation clinique, à la fois dans des établissements de santé bien équipés et dans des environnements à ressources limitées. Cette combinaison innovante d’un immunodosage sur papier et d’une application pour smartphone offre une approche prometteuse pour améliorer la détection et la quantification de l’antigène NS1 de la dengue. En augmentant la sensibilité au-delà des capacités de l’œil nu, ce système présente un grand potentiel pour améliorer la prise de décision clinique dans la prise en charge de la dengue, en particulier dans les zones reculées ou mal desservies.

Introduction

L’infection par le virus de la dengue (DENV) est la maladie transmise par les moustiques qui se propage le plus rapidement¹, et plus de 390 millions de personnes sont infectées par 96 millions d’infections symptomatiques, 2 millions de cas de maladie grave et plus de 25 000 décès par an surviennent dans le monde ^1,2. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 3,9 milliards de personnes sont exposées au risque de dengue ; ~70 % vivent dans les pays d’Asie-Pacifique et principalement en Asie du Sud-Est³. En 2019, le nombre de cas de dengue notifiés à l’OMS était de 4,2 millions, et la Thaïlande a contribué à au moins 136 000 cas de dengue et 144 cas de décès dus à l’infection par la dengue⁴. L’épidémie de dengue en Thaïlande se produit pendant la saison des pluies, d’avril à décembre, dans les zones urbaines et rurales, en particulier dans la région nord-est.

Les infections à DENV ont différentes manifestations cliniques allant des symptômes subcliniques, de la dengue légère à la dengue hémorragique sévère. La principale caractéristique de l’état sévère de DHF est une perméabilité vasculaire accrue suivie d’un choc et d’un dysfonctionnement des organes¹. Comprendre la voie moléculaire qui peut causer la fuite vasculaire est très important pour développer des traitements efficaces contre la dengue. La protéine non structurale 1 (NS1) de la dengue est une glycoprotéine sécrétée au début de l’infection virale ^5,6, et elle fonctionne comme un cofacteur pour la réplication de l’ARN viral⁷. NS1 peut déclencher la libération de cytokines et contribuer à la fuite vasculaire en se liant au récepteur de type Toll 4 (TLR4) et au glycocalyx^{endothélial 8,9}. La recherche in vitro a montré que NS1 interagit avec les cellules endothéliales et induit l’apoptose. Cette condition peut contribuer à un dysfonctionnement endothélial et à une fuite vasculaire¹⁰. Les taux d’antigène NS1, corrélés aux taux sériques d’interleukine (IL)-10, ont augmenté de manière significative chez les patients atteints d’une maladie clinique sévère¹¹. La dengue NS1 contribue également à la pathogenèse de la maladie en induisant l’IL-10 et en supprimant les réponses des lymphocytes T spécifiques à la DENV^12,13. De plus, la protéine NS1 de la dengue était liée à une maladie clinique grave, et la concentration de NS1 > 600 ng mL-1 au cours des 3 premiers jours de la maladie était associée au développement de DHF¹⁴.

La persistance de l’antigène NS1 de la dengue chez les patients atteints de DHF pourrait être utilisée comme marqueur de la dengue sévère⁶. Il existe plusieurs méthodes pour détecter la NS1 dans les échantillons cliniques, telles que le test immuno-enzymatique (ELISA) et le test rapide¹⁵. La méthode ELISA est l’étalon-or pour mesurer la concentration de protéines NS1 en milieu clinique. Cependant, la méthode ELISA est coûteuse et nécessite du personnel qualifié et des installations de laboratoire¹⁶. Par conséquent, le développement de la technologie de détection et de quantification des protéines NS1 dans le test au point de service (POCT) est toujours en cours. Au cours de la dernière décennie, les immunoessais sur papier tels que les tests à flux latéral (LFA) et les dispositifs d’analyse microfluidique sur papier (μPAD) sont devenus populaires comme tests de diagnostic en raison de leur simplicité, de leur rapidité, de leur faible coût et de leur spécificité 17,18,19. Dans un immunoessai sur papier, plusieurs marqueurs ont été utilisés pour générer des signaux, tels que des nanoparticules d’or (AuNPs)²⁰, des nanoparticules magnétiques^21,22, des points quantiques²³ et des matériaux de fluorescence^24,25. Les AuNP sont les étiquettes les plus couramment utilisées dans les immunoessais sur papier en raison de leur faible coût de production, de leur facilité de fabrication, de leur stabilité et de leur lecture simple. Actuellement, les tests à flux latéral (LFA) pour la dengue NS1 sont utilisés en milieu clinique^26,27. Cependant, la détection conventionnelle des étiquettes LFA se fait généralement à l’œil nu et ne fournit que des résultats qualitatifs.

Au cours de la dernière décennie, plus de 5 milliards de smartphones ont été largement utilisés dans le monde, et il existe un potentiel de développement de la détection portable^28,29. Les smartphones ont des capacités multifonctionnelles telles que des capteurs physiques intégrés, des processeurs multicœurs, des appareils photo numériques, des ports USB, des ports audio, des logiciels sans fil et des logiciels d’application, ce qui les rend adaptés à une utilisation dans diverses plates-formes de biocapteurs³⁰. De plus, les technologies sans fil permettent d’envoyer rapidement des données et peuvent être utilisées pour une surveillance en temps réel et sur site³¹. Mudanyali et al. ont combiné le test immunologique sur papier et les smartphones pour développer une plate-forme POCT portable, sans équipement, rapide, peu coûteuse et conviviale pour le paludisme, la tuberculose et le VIH³². Ling et al. ont rapporté un test à flux latéral combiné à l’appareil photo d’un smartphone pour détecter quantitativement l’activité de la phosphatase alcaline dans le lait³³. Hou et al. ont également développé un système d’imagerie à double modalité basé sur un smartphone pour les signaux quantitatifs de la couleur ou de la fluorescence dans le test à flux latéral³⁴. De plus, l’utilisation du smartphone comme lecteur colorimétrique et quantitatif peut améliorer la sensibilité alors que l’œil nu ne peut pas signaler avec certitude la présence de la cible³⁵.

Présentant une percée dans le diagnostic de la dengue, le DEN-NS1-PAD ^36,37,38 (ci-après dénommé l’appareil) offre une solution portable et efficace. Utilisant une technologie à base de papier microfluidique imprimé à la cire, ce dispositif quantifie NS1 avec une sensibilité et une spécificité élevées grâce au traitement d’image. Pour améliorer encore son utilité, nous avons développé une application conviviale pour smartphone pour la lecture colorimétrique et quantitative. La validation clinique à l’aide d’échantillons de patients provenant d’hôpitaux thaïlandais souligne son impact immédiat sur l’évaluation des patients en temps réel. Notre innovation marque une avancée cruciale dans la gestion rationalisée de la dengue au point d’intervention, promettant de révolutionner les diagnostics dans les paysages de soins de santé aux ressources limitées.

Protocol

Le comité d’éthique du comité d’examen institutionnel du département médical de l’armée royale thaïlandaise, hôpital Phramongkutklao, Bangkok, Thaïlande (IRBRTA 1218/2562) a accordé son approbation. En réalisant cette étude, nous avons respecté toutes les règles éthiques nécessaires. 1. Fabrication du dispositif d’immunodosage sur papier REMARQUE : Le dispositif d’immunodosage sur papier a été fabriqué selon les méthodes<…

Representative Results

Le choix d’une méthode de fabrication est essentiel pour garantir des performances de test reproductibles dans les dispositifs d’immunodosage sur papier. Dans notre étude, nous avons exploré divers procédés et matériaux de fabrication dans le contexte de la démonstration d’un immunoessai sur papier. La méthode que nous avons choisie utilise un système d’impression à la cire pour créer des barrières hydrophobes dans des dispositifs microfluidiques à base de papier. Cette approche se distingue par sa s…

Discussion

L’un des paramètres de conception importants d’un système de lecture basé sur smartphone est la capacité à fournir un traitement d’image reproductible des échantillons. Dans cette étude, pour plus de simplicité et de commodité, les images ont été capturées à partir de trois marques de smartphones différentes avec des appareils photo de 12-13 MP sans utiliser de boîtier d’imagerie ou d’accessoires. Les conditions variables de capture d’image, telles que la résolution de la caméra, le temps de …

Materials

Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2)
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein			the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA			the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acid	Merck	10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)	PAA Lab GmbH (Germany)	K41-001
Casein	Merck	9005-46-3
Chromatography paper Grade 2	GE Healthcare	3002-911
Clear laminate film	3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphate	Merck	7558-79-4
Double tape side	Stationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody	MyBiosource (USA)	MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)	Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody	Merck	AG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834236
NS1 serotype 2 antigens	MyBiosource (USA)	MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t			elution buffer
Plastic backing card 10×30 cm	Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)	Sigma Aldrich	P4832
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium monophosphate	Merck	104877
Sodium Chloride	Merck	7647-14-5
Sodium tetraborate	Sigma Aldrich	1303-96-4
Sucrose	Merck	57-50-1
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode reader	BioTek
Mobile phones	Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scanner	Epson Perfection V30
Oven	Memmert
Wax printer	Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentation	Google Cloud
ImageJ	National Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software