Immunodosaggio portatile su carta combinato con l'applicazione per smartphone per la rilevazione colorimetrica e quantitativa dell'antigene NS1 della dengue

Summary

Per rispondere alle esigenze diagnostiche urgenti della dengue, qui presentiamo un dispositivo analitico cartaceo Dengue NS1 integrato nell’app per smartphone (DEN-NS1-PAD) per quantificare la concentrazione dell’antigene Dengue NS1 in campioni clinici di siero/sangue. Questa innovazione migliora la gestione della dengue aiutando il processo decisionale clinico in vari contesti sanitari, anche quelli con risorse limitate.

Abstract

L’infezione da virus della dengue (DENV), trasmessa dalle zanzare Aedes , è una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica nei paesi tropicali e subtropicali. Con un’incidenza annua di circa 10 milioni di casi e 20.000-25.000 decessi, in particolare tra i bambini, c’è un urgente bisogno di strumenti diagnostici pratici. La presenza della proteina non strutturale 1 (NS1) della dengue durante l’infezione precoce è stata collegata al rilascio di citochine, alla perdita vascolare e alla disfunzione endoteliale, rendendola un potenziale marcatore per la dengue grave.

I test immunologici cartacei, come i saggi a flusso laterale (LFA) e i dispositivi analitici microfluidici basati su carta (PAD), hanno guadagnato popolarità come test diagnostici grazie alla loro semplicità, rapidità, economicità, specificità e facilità di interpretazione. Tuttavia, i test immunologici convenzionali su carta per la rilevazione della dengue NS1 si basano in genere sull’ispezione visiva, producendo solo risultati qualitativi. Per ovviare a questa limitazione e migliorare la sensibilità, abbiamo proposto un test di rilevamento della dengue NS1 altamente portatile su un dispositivo analitico (PAD) basato su carta, ovvero DEN-NS1-PAD, che integra un’applicazione per smartphone come lettore colorimetrico e quantitativo. Il sistema di sviluppo consente la quantificazione diretta delle concentrazioni di NS1 nei campioni clinici.

I campioni di siero e di sangue ottenuti dai pazienti sono stati utilizzati per dimostrare le prestazioni del prototipo del sistema. I risultati sono stati ottenuti immediatamente e possono essere utilizzati per la valutazione clinica, sia in strutture sanitarie ben attrezzate che in contesti con risorse limitate. Questa combinazione innovativa di un test immunologico cartaceo con un’applicazione per smartphone offre un approccio promettente per migliorare il rilevamento e la quantificazione dell’antigene NS1 della dengue. Aumentando la sensibilità oltre le capacità dell’occhio nudo, questo sistema ha un grande potenziale per migliorare il processo decisionale clinico nella gestione della dengue, in particolare in aree remote o scarsamente servite.

Introduction

L’infezione da virus dengue (DENV) è la malattia trasmessa dalle zanzare a più rapida diffusione¹ e più di 390 milioni di persone sono infettate da 96 milioni di infezioni sintomatiche, 2 milioni di casi di malattia grave e più di 25.000 decessi all’anno si verificano nel mondo ^1,2. Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), si stima che 3,9 miliardi di persone siano a rischio di dengue; ~70% vive nei paesi dell’Asia-Pacifico e principalmente nel sud-est asiatico³. Nel 2019, il numero di casi di dengue segnalati all’OMS è stato di 4,2 milioni e la Thailandia ha contribuito con almeno 136.000 casi di dengue e 144 casi di morte per infezione da dengue⁴. L’epidemia di dengue in Thailandia si verifica durante la stagione delle piogge, da aprile a dicembre, sia nelle aree urbane che in quelle rurali, soprattutto nell’area nord-orientale.

Le infezioni da DENV hanno diverse manifestazioni cliniche che vanno dai sintomi subclinici, alla febbre dengue lieve (DF) alla febbre emorragica dengue grave (DHF). La caratteristica principale di una grave condizione di DHF è l’aumento della permeabilità vascolare seguito da shock e disfunzione d’organo¹. Comprendere il percorso molecolare che può causare la perdita vascolare è molto importante nello sviluppo di trattamenti efficaci per la dengue. La proteina non strutturale 1 (NS1) della dengue è una glicoproteina secreta durante l’infezione virale^{precoce 5,6} e funziona come cofattore per la replicazione dell’RNA virale⁷. NS1 può innescare il rilascio di citochine e contribuire alla perdita vascolare legandosi al recettore toll-like 4 (TLR4) e al glicocalice endoteliale ^8,9. La ricerca in vitro ha dimostrato che NS1 interagisce con le cellule endoteliali e induce l’apoptosi. Questa condizione può contribuire alla disfunzione endoteliale e alla perdita vascolare¹⁰. I livelli sierici dell’antigene NS1, correlati con i livelli sierici di interleuchina (IL)-10, sono aumentati significativamente nei pazienti con malattia clinica grave¹¹. La dengue NS1 contribuisce anche alla patogenesi della malattia inducendo IL-10 e sopprimendo le risposte delle cellule T specifiche per DENV^12,13. Inoltre, la proteina NS1 della dengue è stata correlata a una grave malattia clinica e la concentrazione di NS1 > 600 ng mL-1 nei primi 3 giorni di malattia è stata associata allo sviluppo di DHF¹⁴.

La persistenza dell’antigene NS1 della dengue nei pazienti con DHF potrebbe essere utilizzata come marcatore di dengue⁶ grave. Esistono diversi metodi per rilevare NS1 nei campioni clinici, come il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e il test rapido¹⁵. Il gold standard per misurare la concentrazione di proteine NS1 in ambito clinico è il metodo ELISA. Tuttavia, il metodo ELISA è costoso e richiede personale qualificato e strutture di laboratorio¹⁶. Pertanto, lo sviluppo di una tecnologia per rilevare e quantificare le proteine NS1 nel test point-of-care (POCT) è ancora in corso. Nell’ultimo decennio, i test immunologici cartacei come i saggi a flusso laterale (LFA) e i dispositivi analitici microfluidici basati su carta (μPAD) sono diventati popolari come test diagnostici grazie alla loro semplicità, rapidità, economicità e specificità 17,18,19. In un test immunologico su carta, sono state utilizzate diverse etichette per generare segnali, come nanoparticelle d’oro (AuNPs⁾²⁰, nanoparticelle magnetiche^21,22, punti quantici²³ e materiali fluorescenti^24,25. Le AuNP sono le etichette più comuni utilizzate nei test immunologici cartacei grazie al loro basso costo di produzione, alla facilità di fabbricazione, alla stabilità e alla semplice lettura. Attualmente, i saggi a flusso laterale (LFA) per la dengue NS1 sono notoriamente utilizzati in ambito clinico^26,27. Tuttavia, il rilevamento convenzionale delle etichette LFA utilizza comunemente l’occhio nudo e fornisce solo risultati qualitativi.

Nell’ultimo decennio, più di 5 miliardi di smartphone sono stati ampiamente utilizzati a livello globale e c’è il potenziale per sviluppare il rilevamento portatile^28,29. Gli smartphone hanno capacità multifunzionali come sensori fisici integrati, processori multi-core, fotocamere digitali, porte USB, porte audio, wireless e software applicativo, che li rendono adatti per l’uso in varie piattaforme di biosensori³⁰. Inoltre, le tecnologie wireless consentono di inviare rapidamente i dati e possono essere utilizzate per il monitoraggio in tempo reale e in loco³¹. Mudanyali et al. hanno combinato il test immunologico cartaceo e gli smartphone per sviluppare una piattaforma POCT portatile, senza apparecchiature, rapida, a basso costo e facile da usare per la malaria, la tubercolosi e l’HIV³². Ling et al. hanno riportato un test a flusso laterale combinato con la fotocamera di uno smartphone per rilevare quantitativamente l’attività della fosfatasi alcalina nel latte³³. Hou et al. hanno anche sviluppato un sistema di imaging a doppia modalità basato su smartphone per segnali quantitativi da colore o fluorescenza nel saggio a flusso laterale³⁴. Inoltre, l’utilizzo dello smartphone come lettore colorimetrico e quantitativo può migliorare la sensibilità mentre l’occhio nudo non può segnalare con sicurezza la presenza del target³⁵.

Rappresentando una svolta nella diagnostica della dengue, il DEN-NS1-PAD 36,37,38 (d’ora in poi denominato dispositivo) offre una soluzione portatile ed efficiente. Utilizzando la tecnologia microfluidica a base di carta stampata a cera, questo dispositivo quantifica NS1 con elevata sensibilità e specificità attraverso l’elaborazione delle immagini. Per migliorarne ulteriormente l’utilità, abbiamo sviluppato un’app per smartphone di facile utilizzo per la lettura colorimetrica e quantitativa. La convalida clinica utilizzando campioni di pazienti provenienti da ospedali thailandesi sottolinea il suo impatto immediato sulla valutazione dei pazienti in tempo reale. La nostra innovazione segna un progresso fondamentale nella gestione semplificata della dengue point-of-care, promettendo di rivoluzionare la diagnostica in ambienti sanitari con risorse limitate.

Protocol

Il Comitato Etico dell’Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailandia (IRBRTA 1218/2562) ha concesso l’approvazione. Nell’effettuare questo studio, abbiamo rispettato tutte le normative etiche necessarie. 1. Fabbricazione del dispositivo del test immunologico su carta NOTA: Il dispositivo di dosaggio immunologico su carta è stato fabbricato seguendo i metodiprecedentemen…

Representative Results

La scelta di un metodo di fabbricazione è fondamentale per garantire prestazioni di dosaggio riproducibili nei dispositivi di dosaggio immunologico su carta. Nel nostro studio, abbiamo esplorato vari processi di produzione e materiali nel contesto della dimostrazione di un test immunologico su carta. Il metodo scelto utilizza un sistema di stampa a cera per creare barriere idrofobiche all’interno di dispositivi microfluidici a base di carta. Questo approccio si distingue per la sua semplicità, velocità e risultati coe…

Discussion

Uno dei parametri di progettazione importanti per un sistema di lettura basato su smartphone è la capacità di fornire un’elaborazione riproducibile delle immagini dei campioni. In questo studio, per semplicità e praticità, le immagini sono state catturate da tre diverse marche di smartphone con fotocamere da 12-13 MP senza l’utilizzo di una scatola di imaging o accessori. Le condizioni variabili di acquisizione dell’immagine, come la risoluzione della fotocamera, il tempo di acquisizione dell’immagine, le condizioni …

Materials

Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2)
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein			the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA			the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acid	Merck	10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)	PAA Lab GmbH (Germany)	K41-001
Casein	Merck	9005-46-3
Chromatography paper Grade 2	GE Healthcare	3002-911
Clear laminate film	3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphate	Merck	7558-79-4
Double tape side	Stationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody	MyBiosource (USA)	MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)	Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody	Merck	AG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834236
NS1 serotype 2 antigens	MyBiosource (USA)	MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t			elution buffer
Plastic backing card 10×30 cm	Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)	Sigma Aldrich	P4832
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium monophosphate	Merck	104877
Sodium Chloride	Merck	7647-14-5
Sodium tetraborate	Sigma Aldrich	1303-96-4
Sucrose	Merck	57-50-1
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode reader	BioTek
Mobile phones	Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scanner	Epson Perfection V30
Oven	Memmert
Wax printer	Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentation	Google Cloud
ImageJ	National Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software