Bærbar papirbasert immunoassay kombinert med smarttelefonapplikasjon for kolorimetrisk og kvantitativ påvisning av Dengue NS1-antigen

Summary

For å adressere presserende dengue-diagnostiske behov, introduserer vi her en smarttelefonapp-integrert Dengue NS1 papirbasert analytisk enhet (DEN-NS1-PAD) for kvantifisering av Dengue NS1-antigenkonsentrasjon i kliniske serum / blodprøver. Denne innovasjonen forbedrer dengue-ledelsen ved å hjelpe klinisk beslutningstaking i ulike helsetjenester, selv ressursbegrensede.

Abstract

Dengue virus (DENV) infeksjon, som overføres av Aedes mygg, er et stort folkehelseproblem i tropiske og subtropiske land. Med en årlig forekomst på ca. 10 millioner tilfeller og 20 000-25 000 dødsfall, spesielt blant barn, er det et presserende behov for praktiske diagnostiske verktøy. Tilstedeværelsen av dengue ikke-strukturelt protein 1 (NS1) under tidlig infeksjon har vært knyttet til cytokinfrigivelse, vaskulær lekkasje og endoteldysfunksjon, noe som gjør det til en potensiell markør for alvorlig dengue.

Papirbaserte immunoassays som laterale strømningsanalyser (LFA) og mikrofluidiske papirbaserte analytiske enheter (PAD) har fått popularitet som diagnostiske tester på grunn av deres enkelhet, hurtighet, billighet, spesifisitet og enkle tolkning. Imidlertid er konvensjonelle papirbaserte immunoassays for dengue NS1-deteksjon vanligvis avhengige av visuell inspeksjon, noe som bare gir kvalitative resultater. For å løse denne begrensningen og forbedre følsomheten, foreslo vi en svært bærbar NS1 dengue-deteksjonsanalyse på en papirbasert analytisk enhet (PAD), nemlig DEN-NS1-PAD, som integrerer en smarttelefonapplikasjon som en kolorimetrisk og kvantitativ leser. Utviklingssystemet muliggjør direkte kvantifisering av NS1-konsentrasjoner i kliniske prøver.

Serum- og blodprøver tatt fra pasienter ble brukt til å demonstrere systemets prototypeytelse. Resultatene ble oppnådd umiddelbart og kan brukes til klinisk vurdering, både i velutstyrte helseinstitusjoner og ressursbegrensede innstillinger. Denne innovative kombinasjonen av en papirbasert immunoassay med en smarttelefonapplikasjon gir en lovende tilnærming for forbedret deteksjon og kvantifisering av dengue NS1-antigen. Ved å øke følsomheten utover evnen til det blotte øye, har dette systemet stort potensial for å forbedre klinisk beslutningstaking i dengue-ledelse, spesielt i fjerntliggende eller underbetjente områder.

Introduction

Denguevirus (DENV) infeksjon er den raskest spredende myggbårne sykdommen¹, og mer enn 390 millioner mennesker er smittet med 96 millioner symptomatiske infeksjoner, 2 millioner tilfeller av alvorlig sykdom, og mer enn 25.000 dødsfall per år forekommer i verden ^1,2. Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) er anslagsvis 3,9 milliarder mennesker i fare for dengue; ~ 70% bor i Asia Pacific-landene og hovedsakelig i Sørøst-Asia³. I 2019 var antall dengue-tilfeller rapportert til WHO 4,2 millioner, og Thailand bidro med minst 136 000 dengue-tilfeller og 144 dødsfall fra dengueinfeksjon⁴. Dengue-utbruddet i Thailand skjer i regntiden, fra april til desember, i både urbane og landlige områder, spesielt i det nordøstlige området.

DENV-infeksjoner har forskjellige kliniske manifestasjoner som spenner fra subkliniske symptomer, mild denguefeber (DF) til alvorlig dengue hemoragisk feber (DHF). Hovedkarakteristikken for alvorlig DHF-tilstand er økt vaskulær permeabilitet etterfulgt av sjokk og organdysfunksjon¹. Å forstå den molekylære banen som kan forårsake vaskulær lekkasje er svært viktig for å utvikle effektive dengue-behandlinger. Dengue ikke-strukturelt protein 1 (NS1) er et utskilt glykoprotein under tidlig virusinfeksjon ^5,6, og det fungerer som en kofaktor for viral RNA-replikasjon⁷. NS1 kan utløse cytokinfrigjøring og bidra til vaskulær lekkasje ved å binde seg til tolllignende reseptor 4 (TLR4) og endotelial glykokalyks ^8,9. In vitro-forskning har vist at NS1 interagerer med endotelceller og induserer apoptose. Denne tilstanden kan bidra til endoteldysfunksjon og vaskulær lekkasje¹⁰. NS1-antigennivåer, korrelert med serum interleukin (IL)-10-nivåer, økte signifikant hos pasienter med alvorlig klinisk sykdom¹¹. Dengue NS1 bidrar også til sykdomspatogenese ved å indusere IL-10 og undertrykke DENV-spesifikke T-celleresponser^12,13. I tillegg var dengue NS1-protein relatert til alvorlig klinisk sykdom, og konsentrasjonen av NS1 > 600 ng ml-1 i de første 3 dagene av sykdommen var assosiert med utviklingen av DHF¹⁴.

Persistensen av dengue NS1-antigenet hos pasienter med DHF kan brukes som markør for alvorlig dengue⁶. Det finnes flere metoder for å påvise NS1 i kliniske prøver som enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og hurtigtest¹⁵. Gullstandarden for måling av konsentrasjonen av NS1-proteiner i en klinisk setting er ELISA-metoden. ELISA-metoden er imidlertid kostbar og krever faglært personell og laboratoriefasiliteter¹⁶. Derfor pågår utviklingen av teknologi for påvisning og kvantifisering av NS1-proteiner i pasientnær test (POCT) fortsatt. I det siste tiåret har papirbaserte immunoassays som laterale strømningsanalyser (LFA) og mikrofluidiske papirbaserte analytiske enheter (μPAD) blitt populære som diagnostiske tester på grunn av deres enkelhet, hurtighet, billighet og spesifisitet 17,18,19. I en papirbasert immunoassay har flere etiketter blitt brukt til å generere signaler, for eksempel gull nanopartikler (AuNPs) ²⁰, magnetiske nanopartikler^21,22, kvanteprikker²³ og fluorescensmaterialer ^24,25. AuNP er de vanligste etikettene som brukes i papirbaserte immunoassays på grunn av deres billige produksjonskostnader, enkel produksjon, stabilitet og enkel avlesning. For tiden brukes laterale strømningsanalyser (LFAer) for dengue NS1 i klinisk setting^26,27. Imidlertid bruker konvensjonell LFA-etikettdeteksjon vanligvis det blotte øye og gir bare kvalitative resultater.

I løpet av det siste tiåret har mer enn 5 milliarder smarttelefoner blitt mye brukt globalt, og det er potensial for å utvikle bærbar deteksjon^28,29. Smarttelefoner har multifunksjonelle kapasiteter som innebygde fysiske sensorer, flerkjerneprosessorer, digitale kameraer, USB-porter, lydporter, trådløs og applikasjonsprogramvare, noe som gjør dem egnet for bruk i forskjellige biosensorplattformer³⁰. I tillegg tillater trådløs teknologi at data sendes raskt og kan brukes til sanntids- og overvåking på stedet³¹. Mudanyali et al. kombinerte papirbasert immunoassay og smarttelefoner for å utvikle en bærbar, utstyrsfri, rask, billig og brukervennlig POCT-plattform for malaria, tuberkulose og HIV³². Ling et al. rapporterte en lateral strømningsanalyse kombinert med et smarttelefonkamera for å oppdage alkalisk fosfataseaktivitet i melk kvantitativt³³. Hou et al. utviklet også et smarttelefonbasert, dual-modalitetsbildesystem for kvantitative signaler fra farge eller fluorescens i lateral flow assay³⁴. I tillegg kan bruk av smarttelefonen som en kolorimetrisk og kvantitativ leser forbedre følsomheten mens det blotte øye ikke trygt kan rapportere tilstedeværelsen av målet³⁵.

DEN-NS1-PAD 36,37,38 (heretter referert til som enheten) presenterer et gjennombrudd innen denguediagnostikk, og tilbyr en bærbar og effektiv løsning. Ved hjelp av vokstrykt mikrofluidisk papirbasert teknologi kvantifiserer denne enheten NS1 med høy følsomhet og spesifisitet gjennom bildebehandling. For å forbedre nytten ytterligere har vi utviklet en brukervennlig smarttelefonapp for kolorimetrisk og kvantitativ lesing. Klinisk validering ved hjelp av pasientprøver fra thailandske sykehus understreker den umiddelbare effekten på pasientvurdering i sanntid. Vår innovasjon markerer et sentralt fremskritt innen strømlinjeformet, point-of-care-dengue-ledelse, og lover å revolusjonere diagnostikk i ressursbegrensede helselandskap.

Protocol

Den etiske komiteen i Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailand (IRBRTA 1218/2562) ga godkjenning. I gjennomføringen av denne studien fulgte vi alle nødvendige etiske forskrifter. 1. Enhetsfabrikasjon av den papirbaserte Immunoassay MERK: Den papirbaserte immunoassay-enheten ble produsert etter tidligere etablerte metoder36,37…

Representative Results

Valg av fabrikasjonsmetode er avgjørende for å sikre reproduserbare analyseytelser i papirbaserte immunoassay-enheter. I vår studie utforsket vi ulike produksjonsprosesser og materialer i sammenheng med å demonstrere en papirbasert immunoassay. Vår valgte metode benytter et voksutskriftssystem for å skape hydrofobe barrierer i papirbaserte mikrofluidiske enheter. Denne tilnærmingen skiller seg ut på grunn av sin enkelhet, hastighet og konsistente resultater. Merk at det gir fordelen av å unngå bruk av fotoresis…

Discussion

En av de viktige designparametrene for et smarttelefonbasert lesersystem er muligheten til å gi reproduserbar bildebehandling av prøver. I denne studien, for enkelhet og bekvemmelighet, ble bildene tatt fra tre forskjellige smarttelefonmerker med 12-13 MP kameraer uten å bruke en bildeboks eller tilbehør. Varierende forhold for bildeopptak, for eksempel kameraets oppløsning, tid for bildeopptak, lysforhold og miljø, kan påvirke fargeintensiteten til test- og kontrollpunktene på enheten. Virkningen av forskjellige…

Materials

Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2)
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein			the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA			the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acid	Merck	10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)	PAA Lab GmbH (Germany)	K41-001
Casein	Merck	9005-46-3
Chromatography paper Grade 2	GE Healthcare	3002-911
Clear laminate film	3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphate	Merck	7558-79-4
Double tape side	Stationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody	MyBiosource (USA)	MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)	Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody	Merck	AG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834236
NS1 serotype 2 antigens	MyBiosource (USA)	MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t			elution buffer
Plastic backing card 10×30 cm	Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)	Sigma Aldrich	P4832
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium monophosphate	Merck	104877
Sodium Chloride	Merck	7647-14-5
Sodium tetraborate	Sigma Aldrich	1303-96-4
Sucrose	Merck	57-50-1
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode reader	BioTek
Mobile phones	Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scanner	Epson Perfection V30
Oven	Memmert
Wax printer	Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentation	Google Cloud
ImageJ	National Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software