Imunoensaio Portátil Baseado em Papel Combinado com Aplicativo para Smartphone para Detecção Colorimétrica e Quantitativa do Antígeno NS1 da Dengue

Summary

Atendendo às necessidades urgentes de diagnóstico da dengue, apresentamos aqui um dispositivo analítico baseado em papel para dengue NS1 integrado ao aplicativo para smartphone (DEN-NS1-PAD) para quantificar a concentração do antígeno NS1 da dengue em amostras clínicas de soro/sangue. Essa inovação aprimora o manejo da dengue, auxiliando a tomada de decisões clínicas em vários ambientes de saúde, mesmo aqueles com recursos limitados.

Abstract

A infecção pelo vírus da dengue (DENV), que é transmitido por mosquitos Aedes , é um grande problema de saúde pública em países tropicais e subtropicais. Com uma incidência anual de aproximadamente 10 milhões de casos e 20.000-25.000 mortes, particularmente entre crianças, há uma necessidade urgente de ferramentas práticas de diagnóstico. A presença da proteína não-estrutural 1 (NS1) da dengue durante a infecção precoce tem sido associada à liberação de citocinas, extravasamento vascular e disfunção endotelial, tornando-a um marcador potencial para dengue grave.

Imunoensaios baseados em papel, como ensaios de fluxo lateral (LFAs) e dispositivos analíticos microfluídicos baseados em papel (PADs), ganharam popularidade como testes diagnósticos devido à sua simplicidade, rapidez, baixo custo, especificidade e facilidade de interpretação. No entanto, os imunoensaios convencionais baseados em papel para detecção de NS1 da dengue normalmente dependem de inspeção visual, produzindo apenas resultados qualitativos. Para abordar essa limitação e aumentar a sensibilidade, propusemos um ensaio de detecção de dengue NS1 altamente portátil em um Dispositivo Analítico Baseado em Papel (PAD), ou seja, DEN-NS1-PAD, que integra um aplicativo de smartphone como um leitor colorimétrico e quantitativo. O sistema de desenvolvimento permite a quantificação direta das concentrações de NS1 em amostras clínicas.

Amostras de soro e sangue obtidas dos pacientes foram utilizadas para demonstrar o desempenho do protótipo do sistema. Os resultados foram obtidos imediatamente e podem ser empregados para avaliação clínica, tanto em instalações de saúde bem equipadas quanto em ambientes com recursos limitados. Esta combinação inovadora de um imunoensaio baseado em papel com um aplicativo de smartphone oferece uma abordagem promissora para detecção e quantificação aprimoradas do antígeno NS1 da dengue. Ao aumentar a sensibilidade além das capacidades a olho nu, esse sistema tem grande potencial para melhorar a tomada de decisão clínica no manejo da dengue, particularmente em áreas remotas ou carentes.

Introduction

A infecção pelo vírus da dengue (DENV) é a doença transmitida por mosquitos de mais rápida propagação¹, e mais de 390 milhões de pessoas estão infectadas com 96 milhões de infecções sintomáticas, 2 milhões de casos de doença grave e mais de 25.000 mortes por ano ocorrem no mundo ^1,2. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 3,9 bilhões de pessoas estejam em risco de dengue; ~70% vivem em países da Ásia-Pacífico e principalmente no Sudeste Asiático³. Em 2019, o número de casos de dengue relatados à OMS foi de 4,2 milhões, e a Tailândia contribuiu com pelo menos 136.000 casos de dengue e 144 casos de morte por infecção por dengue⁴. O surto de dengue na Tailândia ocorre durante a estação chuvosa, de abril a dezembro, em áreas urbanas e rurais, especialmente na área nordeste.

As infecções por DENV têm diferentes manifestações clínicas, desde sintomas subclínicos, dengue leve (FD) até dengue hemorrágica grave (FHD). A principal característica da condição grave de FHD é o aumento da permeabilidade vascular, seguido de choque e disfunção orgânica¹. A compreensão da via molecular que pode causar o extravasamento vascular é muito importante no desenvolvimento de tratamentos eficazes para a dengue. A proteína não-estrutural 1 (NS1) do dengue é uma glicoproteína secretada durante a infecção viral precoce ^5,6 e funciona como cofator para a replicação do RNA viral⁷. A NS1 pode desencadear a liberação de citocinas e contribuir para o extravasamento vascular ao se ligar ao receptor toll-like 4 (TLR4) e ao glicocálice endotelial ^8,9. Pesquisas in vitro mostraram que a NS1 interage com células endoteliais e induz apoptose. Essa condição pode contribuir para disfunção endotelial e extravasamento vascular¹⁰. Os níveis séricos do antígeno NS1, correlacionados com os níveis séricos de Interleucina (IL)-10, estavam aumentados significativamente em pacientes com doença clínica grave¹¹. A NS1 do dengue também contribui para a patogênese da doença ao induzir IL-10 e suprimir as respostas específicas de células T DENV^12,13. Além disso, a proteína NS1 da dengue foi relacionada à doença clínica grave, e a concentração de NS1 > 600 ng mL-1 nos primeiros 3 dias de doença foi associada ao desenvolvimento de FHD¹⁴.

A persistência do antígeno NS1 da dengue em pacientes com FHD poderia ser utilizada como marcador de dengue^grave6. Existem vários métodos para detectar a NS1 em amostras clínicas, como o ensaio imunoenzimático (ELISA) e o teste^rápido15. O padrão-ouro para medir a concentração de proteínas NS1 em um ambiente clínico é o método ELISA. No entanto, o método ELISA é caro e requer pessoal qualificado e instalações laboratoriais¹⁶. Portanto, o desenvolvimento de tecnologia para detecção e quantificação de proteínas NS1 no teste point-of-care (POCT) ainda está em andamento. Na última década, imunoensaios baseados em papel, como os ensaios de fluxo lateral (LFAs) e dispositivos analíticos microfluídicos baseados em papel (μPADs), tornaram-se populares como testes diagnósticos devido à sua simplicidade, rapidez, baixo custo e especificidade 17,18,19. Em um imunoensaio baseado em papel, vários marcadores têm sido usados para gerar sinais, como nanopartículas de ouro (AuNPs)²⁰, nanopartículas magnéticas^21,22, pontos quânticos²³ e materiais de fluorescência^24,25. AuNPs são os rótulos mais comuns usados em imunoensaios baseados em papel devido ao seu custo barato de produção, facilidade de fabricação, estabilidade e leitura simples. Atualmente, os ensaios de fluxo lateral (AFLs) para a NS1 da dengue são notoriamente utilizados no cenário clínico^26,27. No entanto, a detecção convencional de rótulos de LFA comumente usa o olho nu e fornece apenas resultados qualitativos.

Na última década, mais de 5 bilhões de smartphones foram amplamente utilizados globalmente, e há potencial para o desenvolvimento de detecção portátil^28,29. Os smartphones possuem capacidades multifuncionais, como sensores físicos integrados, processadores multi-core, câmeras digitais, portas USB, portas de áudio, wireless e software aplicativo, tornando-os adequados para uso em diversas plataformas de biossensores³⁰. Além disso, as tecnologias sem fio permitem que os dados sejam enviados rapidamente e podem ser usados para monitoramento em tempo real e no local³¹. combinaram o imunoensaio baseado em papel e smartphones para desenvolver uma plataforma POCT portátil, livre de equipamentos, rápida, de baixo custo e fácil de usar para malária, tuberculose e HIV³². relataram um ensaio de fluxo lateral combinado com uma câmera de smartphone para detectar quantitativamente a atividade da fosfatase alcalina no leite³³. Hou e col. também desenvolveram um sistema de imagem de dupla modalidade baseado em smartphone para sinais quantitativos de cor ou fluorescência no ensaio de fluxo lateral³⁴. Além disso, usar o smartphone como leitor colorimétrico e quantitativo pode melhorar a sensibilidade, enquanto o olho nu não pode relatar com confiança a presença do alvo³⁵.

Apresentando um avanço no diagnóstico da dengue, o DEN-NS1-PAD 36,37,38 (doravante denominado dispositivo) oferece uma solução portátil e eficiente. Usando a tecnologia à base de papel microfluídico impresso em cera, este dispositivo quantifica a NS1 com alta sensibilidade e especificidade através do processamento de imagens. Para melhorar ainda mais sua utilidade, desenvolvemos um aplicativo de smartphone amigável para leitura colorimétrica e quantitativa. A validação clínica usando amostras de pacientes de hospitais tailandeses ressalta seu impacto imediato na avaliação do paciente em tempo real. Nossa inovação marca um avanço fundamental no gerenciamento simplificado da dengue no ponto de atendimento, prometendo revolucionar os diagnósticos em cenários de saúde com recursos limitados.

Protocol

O Comitê de Ética do Comitê de Revisão Institucional, Departamento Médico do Exército Real Tailandês, Hospital Phramongkutklao, Bangkok, Tailândia (IRBRTA 1218/2562) concedeu aprovação. Na realização deste estudo, foram cumpridas todas as normas éticas necessárias. 1. Fabricação do dispositivo de imunoensaio baseado em papel NOTA: O dispositivo de imunoensaio em papel foi fabricado seguindo métodos previamente estabelecidos<sup class=…

Representative Results

A seleção de um método de fabricação é fundamental para garantir desempenhos de ensaio reprodutíveis em dispositivos de imunoensaio baseados em papel. Em nosso estudo, exploramos vários processos de fabricação e materiais no contexto da demonstração de um imunoensaio baseado em papel. Nosso método escolhido utiliza um sistema de impressão de cera para criar barreiras hidrofóbicas dentro de dispositivos microfluídicos à base de papel. Essa abordagem se destaca pela simplicidade, rapidez e resultados consi…

Discussion

Um dos parâmetros de projeto importantes para um sistema leitor baseado em smartphone é a capacidade de fornecer processamento de imagem reprodutível de amostras. Neste estudo, para simplicidade e conveniência, as imagens foram capturadas de três marcas diferentes de smartphones com câmeras de 12 a 13 MP, sem o uso de caixa de imagem ou acessórios. Condições variáveis de captura de imagem, como a resolução da câmera, o tempo de captura da imagem, as condições de iluminação e o ambiente, podem influenciar…

Materials

Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2)
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein			the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA			the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acid	Merck	10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)	PAA Lab GmbH (Germany)	K41-001
Casein	Merck	9005-46-3
Chromatography paper Grade 2	GE Healthcare	3002-911
Clear laminate film	3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphate	Merck	7558-79-4
Double tape side	Stationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody	MyBiosource (USA)	MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)	Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody	Merck	AG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834236
NS1 serotype 2 antigens	MyBiosource (USA)	MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t			elution buffer
Plastic backing card 10×30 cm	Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)	Sigma Aldrich	P4832
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium monophosphate	Merck	104877
Sodium Chloride	Merck	7647-14-5
Sodium tetraborate	Sigma Aldrich	1303-96-4
Sucrose	Merck	57-50-1
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode reader	BioTek
Mobile phones	Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scanner	Epson Perfection V30
Oven	Memmert
Wax printer	Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentation	Google Cloud
ImageJ	National Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software