Bärbar pappersbaserad immunanalys i kombination med smartphone-applikation för kolorimetrisk och kvantitativ detektion av dengue NS1-antigen

Summary

För att ta itu med brådskande behov av denguediagnostik introducerar vi här en smartphone-app-integrerad Dengue NS1 Paper-based Analytical Device (DEN-NS1-PAD) för kvantifiering av Dengue NS1-antigenkoncentration i kliniska serum-/blodprover. Denna innovation förbättrar hanteringen av denguefeber genom att underlätta kliniskt beslutsfattande i olika vårdmiljöer, även resursbegränsade sådana.

Abstract

Denguevirusinfektion (DENV), som överförs av Aedes-myggor , är ett stort folkhälsoproblem i tropiska och subtropiska länder. Med en årlig incidens på cirka 10 miljoner fall och 20 000-25 000 dödsfall, särskilt bland barn, finns det ett akut behov av praktiska diagnostiska verktyg. Förekomsten av icke-strukturellt dengueprotein 1 (NS1) under tidig infektion har kopplats till cytokinfrisättning, vaskulärt läckage och endoteldysfunktion, vilket gör det till en potentiell markör för svår dengue.

Pappersbaserade immunanalyser som laterala flödesanalyser (LFA) och mikrofluidiska pappersbaserade analysanordningar (PAD) har vunnit popularitet som diagnostiska tester på grund av deras enkelhet, snabbhet, billighet, specificitet och enkla tolkning. Konventionella pappersbaserade immunanalyser för detektion av NS1 i denguefeber förlitar sig dock vanligtvis på visuell inspektion och ger endast kvalitativa resultat. För att ta itu med denna begränsning och förbättra känsligheten föreslog vi en mycket portabel NS1-detektionsanalys av denguefeber på en pappersbaserad analysenhet (PAD), nämligen DEN-NS1-PAD, som integrerar en smartphone-applikation som en kolorimetrisk och kvantitativ läsare. Utvecklingssystemet möjliggör direkt kvantifiering av NS1-koncentrationer i kliniska prover.

Serum- och blodprover från patienter användes för att demonstrera systemprototypens prestanda. Resultaten erhölls omedelbart och kan användas för klinisk bedömning, både i välutrustade vårdinrättningar och i resursbegränsade miljöer. Denna innovativa kombination av en pappersbaserad immunanalys med en smartphone-applikation erbjuder ett lovande tillvägagångssätt för förbättrad detektion och kvantifiering av NS1-dengueantigen. Genom att öka känsligheten bortom blotta ögats kapacitet har detta system stor potential för att förbättra det kliniska beslutsfattandet vid hantering av denguefeber, särskilt i avlägsna eller underbetjänade områden.

Introduction

Denguevirusinfektion (DENV) är den myggburna^{sjukdomen som} sprids snabbast 1, och mer än 390 miljoner människor är infekterade med 96 miljoner symtomatiska infektioner, 2 miljoner fall av allvarlig sjukdom och mer än 25 000 dödsfall per år inträffar i världen ^1,2. Enligt Världshälsoorganisationen (WHO) är uppskattningsvis 3,9 miljarder människor i riskzonen för denguefeber. ~70% bor i länder i Asien och Stillahavsområdet och främst i Sydostasien³. År 2019 rapporterades 4,2 miljoner fall av denguefeber till WHO, och Thailand bidrog med minst 136 000 fall av denguefeber och 144 dödsfall till följd av dengueinfektion⁴. Dengueutbrottet i Thailand sker under regnperioden, från april till december, i både stads- och landsbygdsområden, särskilt i det nordöstra området.

DENV-infektioner har olika kliniska manifestationer som sträcker sig från subkliniska symtom, mild denguefeber (DF) till svår dengue hemorragisk feber (DHF). Det huvudsakliga kännetecknet för allvarligt DHF-tillstånd är ökad vaskulär permeabilitet följt av chock och organdysfunktion¹. Att förstå den molekylära vägen som kan orsaka kärlläckage är mycket viktigt för att utveckla effektiva denguebehandlingar. Dengue icke-strukturellt protein 1 (NS1) är ett utsöndrat glykoprotein under tidig virusinfektion ^5,6, och det fungerar som en kofaktor för viral RNA-replikation⁷. NS1 kan utlösa cytokinfrisättning och bidra till vaskulärt läckage genom att binda till toll-like receptor 4 (TLR4) och endotelglykokalyx ^8,9. In vitro-forskning har visat att NS1 interagerar med endotelceller och inducerar apoptos. Detta tillstånd kan bidra till endoteldysfunktion och vaskulärt läckage¹⁰. NS1-antigennivåer, korrelerade med serumnivåer av interleukin (IL)-10, ökade signifikant hos patienter med svår klinisk sjukdom¹¹. Dengue NS1 bidrar också till sjukdomspatogenesen genom att inducera IL-10 och undertrycka DENV-specifika T-cellssvar^12,13. Dessutom var NS1-proteinet denguefeber relaterat till svår klinisk sjukdom, och koncentrationen av NS1 > 600 ng ml-1 under de första 3 dagarna av sjukdomen var associerad med utvecklingen av DHF¹⁴.

Persistensen av dengue NS1-antigenet hos patienter med DHF kan användas som en markör för svår dengue⁶. Det finns flera metoder för att detektera NS1 i kliniska prover, t.ex. enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) och snabbtest¹⁵. Guldstandarden för att mäta koncentrationen av NS1-proteiner i en klinisk miljö är ELISA-metoden. ELISA-metoden är dock dyr och kräver kvalificerad personal och laboratorieutrustning¹⁶. Därför pågår fortfarande utvecklingen av teknik för att detektera och kvantifiera NS1-proteiner i patientnära test (POCT). Under det senaste decenniet har pappersbaserade immunanalyser som laterala flödesanalyser (LFA) och mikrofluidiska pappersbaserade analysanordningar (μPAD) blivit populära som diagnostiska tester på grund av deras enkelhet, snabbhet, billighet och specificitet 17,18,19. I en pappersbaserad immunanalys har flera etiketter använts för att generera signaler, såsom guldnanopartiklar (AuNPs)²⁰, magnetiska nanopartiklar^21,22, kvantprickar²³ och fluorescensmaterial^24,25. AuNP är de vanligaste etiketterna som används i pappersbaserade immunanalyser på grund av deras billiga produktionskostnad, enkla tillverkning, stabilitet och enkla avläsning. För närvarande används laterala flödesanalyser (LFA) för dengue NS1 i den kliniska miljön^26,27. Konventionell LFA-etikettdetektering använder dock vanligtvis blotta ögat och ger endast kvalitativa resultat.

Under det senaste decenniet har mer än 5 miljarder smartphones använts i stor utsträckning globalt, och det finns potential för att utveckla bärbar detektering ^28,29. Smartphones har multifunktionell kapacitet som inbyggda fysiska sensorer, flerkärniga processorer, digitalkameror, USB-portar, ljudportar, trådlös och applikationsprogramvara, vilket gör dem lämpliga för användning i olika biosensorplattformar³⁰. Dessutom gör trådlös teknik det möjligt att skicka data snabbt och kan användas för övervakning i realtid och på plats³¹. Mudanyali et al. kombinerade den pappersbaserade immunanalysen och smartphones för att utveckla en bärbar, utrustningsfri, snabb, billig och användarvänlig POCT-plattform för malaria, tuberkulos och HIV³². Ling et al. rapporterade en lateral flödesanalys i kombination med en smartphonekamera för att kvantitativt detektera alkalisk fosfatasaktivitet i mjölk³³. Hou et al. utvecklade också ett smartphone-baserat, dual-modality imaging system för kvantitativa signaler från färg eller fluorescens i den laterala flödesanalysen³⁴. Att använda smarttelefonen som en kolorimetrisk och kvantitativ läsare kan dessutom förbättra känsligheten medan blotta ögat inte med säkerhet kan rapportera närvaron av målet³⁵.

DEN-NS1-PAD 36,37,38 (hädanefter kallad enheten) är ett genombrott inom denguediagnostik och erbjuder en bärbar och effektiv lösning. Med hjälp av vaxtryckt mikrofluidisk pappersbaserad teknik kvantifierar denna enhet NS1 med hög känslighet och specificitet genom bildbehandling. För att ytterligare förbättra dess användbarhet har vi utvecklat en användarvänlig smartphone-app för kolorimetrisk och kvantitativ avläsning. Klinisk validering med hjälp av patientprover från thailändska sjukhus understryker dess omedelbara inverkan på patientbedömning i realtid. Vår innovation markerar ett avgörande framsteg inom strömlinjeformad, patientnära denguehantering, och lovar att revolutionera diagnostiken i resursbegränsade vårdlandskap.

Protocol

Etikkommittén vid Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailand (IRBRTA 1218/2562) beviljade godkännande. När vi genomförde denna studie följde vi alla nödvändiga etiska regler. 1. Tillverkning av produkter för den pappersbaserade immunanalysen OBS: Den pappersbaserade immunanalysenheten tillverkades enligt tidigare etablerade metoder36,37<sup clas…

Representative Results

Att välja en tillverkningsmetod är avgörande för att säkerställa reproducerbara analysprestanda i pappersbaserade immunanalysenheter. I vår studie undersökte vi olika tillverkningsprocesser och material i samband med att demonstrera en pappersbaserad immunanalys. Vår valda metod använder ett vaxutskriftssystem för att skapa hydrofoba barriärer i pappersbaserade mikrofluidiska enheter. Detta tillvägagångssätt sticker ut på grund av dess enkelhet, snabbhet och konsekventa resultat. Värt att notera är att …

Discussion

En av de viktiga designparametrarna för ett smartphone-baserat läsarsystem är förmågan att tillhandahålla reproducerbar bildbehandling av prover. I den här studien togs bilderna från tre olika smartphone-märken med 12-13 MP-kameror utan att använda en bildbox eller tillbehör. Varierande förhållanden för bildtagning, såsom kamerans upplösning, bildtagningstid, ljusförhållanden och miljö, kan påverka färgintensiteten på test- och kontrollpunkterna på enheten. Effekten av olika bildtagningstider på b…

Materials

Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2)
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein			the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA			the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acid	Merck	10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)	PAA Lab GmbH (Germany)	K41-001
Casein	Merck	9005-46-3
Chromatography paper Grade 2	GE Healthcare	3002-911
Clear laminate film	3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphate	Merck	7558-79-4
Double tape side	Stationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody	MyBiosource (USA)	MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)	Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody	Merck	AG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834236
NS1 serotype 2 antigens	MyBiosource (USA)	MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t			elution buffer
Plastic backing card 10×30 cm	Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)	Sigma Aldrich	P4832
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium monophosphate	Merck	104877
Sodium Chloride	Merck	7647-14-5
Sodium tetraborate	Sigma Aldrich	1303-96-4
Sucrose	Merck	57-50-1
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode reader	BioTek
Mobile phones	Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scanner	Epson Perfection V30
Oven	Memmert
Wax printer	Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentation	Google Cloud
ImageJ	National Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software