デング熱NS1抗原の比色および定量検出のためのスマートフォンアプリケーションと組み合わせたポータブル紙ベースのイムノアッセイ
Summary
ここでは、デング熱の診断ニーズに応えるため、臨床血清・血液サンプル中のデング熱NS1抗原濃度を定量するスマートフォンアプリ内蔵デング熱NS1紙ベース分析装置(DEN-NS1-PAD)をご紹介します。このイノベーションは、リソースが限られているものも含めて、さまざまな医療現場での臨床的意思決定を支援することで、デング熱の管理を強化します。
Abstract
ネッタイシマカによって媒介されるデングウイルス(DENV)感染症は、熱帯および亜熱帯諸国における主要な公衆衛生上の懸念事項です。年間約1,000万人の患者と20,000〜25,000人の死亡者、特に子供の間では、実用的な診断ツールが緊急に必要とされています。デング熱の非構造タンパク質1(NS1)は、感染初期にサイトカインの放出、血管漏出、内皮機能障害と関連しており、重度のデング熱のマーカーとなる可能性があります。
ラテラルフローアッセイ(LFA)やマイクロ流体紙ベースの分析デバイス(PAD)などの紙ベースのイムノアッセイは、その簡便性、迅速性、安価性、特異性、および解釈の容易さから、診断検査として人気を博しています。しかし、デング熱NS1検出のための従来の紙ベースのイムノアッセイは、通常、目視検査に依存しており、定性的な結果しか得られません。この限界に対処し、感度を高めるために、スマートフォンアプリケーションを比色および定量リーダーとして統合した、紙ベースの分析装置(PAD)でのポータブル性の高いNS1デング検出アッセイ、つまりDEN-NS1-PADを提案しました。この開発システムにより、臨床サンプル中のNS1濃度を直接定量することができます。
患者から採取した血清・血液サンプルを用いて、システムの試作性能を実証しました。結果はすぐに得られ、設備の整った医療施設とリソースが限られている環境の両方で、臨床評価に採用できます。紙ベースのイムノアッセイとスマートフォンアプリケーションのこの革新的な組み合わせは、デング熱NS1抗原の検出と定量を強化するための有望なアプローチを提供します。このシステムは、肉眼の能力を超えて感度を高めることにより、特に遠隔地やサービスの行き届いていない地域におけるデング熱管理における臨床的意思決定を改善する大きな可能性を秘めています。
Introduction
デングウイルス(DENV)感染症は、蚊が媒介する病気としては最も急速に広がり1、世界では年間3億9,000万人以上が9,600万人の症候性感染症に感染し、200万人が重症化し、2万5,000人以上が死亡しています1,2。世界保健機関(WHO)によると、推定39億人がデング熱のリスクにさらされています。~70%がアジア太平洋諸国、主に東南アジアに住んでいます3.2019年にWHOに報告されたデング熱の症例数は420万人で、タイでは少なくとも136,000人のデング熱患者と144人のデング熱感染による死亡例が144件ありました4。タイでのデング熱の流行は、4月から12月までの雨季に、都市部と農村部、特に北東部で発生します。
DENV感染症は、無症候性症状、軽度のデング熱(DF)から重度のデング出血熱(DHF)まで、さまざまな臨床症状を示します。重度のDHF状態の主な特徴は、血管透過性の増加であり、ショックと臓器機能障害が続きます1。血管漏出を引き起こす可能性のある分子経路を理解することは、効果的なデング熱治療薬を開発する上で非常に重要です。デング熱の非構造タンパク質1(NS1)は、ウイルス感染初期に分泌される糖タンパク質であり5,6、ウイルスRNA複製の補因子として機能します7。NS1は、サイトカインの放出を誘発し、Toll様受容体4(TLR4)および内皮グリコカリックス8,9に結合することにより、血管漏出に寄与します。In vitroの研究により、NS1は内皮細胞と相互作用し、アポトーシスを誘導することが示されています。この状態は、内皮機能障害および血管漏出に寄与し得る10。血清インターロイキン(IL)-10レベルと相関するNS1抗原レベルは、重度の臨床疾患を有する患者で有意に増加した11。デング熱NS1は、IL-10を誘導し、DENV特異的T細胞応答を抑制することにより、疾患の病因にも寄与します12,13。さらに、デング熱NS1タンパク質は重篤な臨床疾患に関連しており、発症後3日間のNS1>600ng mL-1の濃度はDHF14の発症と関連していた。
DHF患者におけるデング熱NS1抗原の持続性は、重症デング熱6のマーカーとして使用できる可能性があります。臨床サンプル中のNS1を検出するには、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)や迅速検査15など、いくつかの方法があります。臨床現場でNS1タンパク質の濃度を測定するためのゴールドスタンダードは、ELISA法です。しかし、ELISA法は高価であり、熟練した人員と実験設備を必要とする16。そのため、ポイントオブケア検査(POCT)でNS1タンパク質を検出・定量する技術の開発は、現在も進行中です。過去10年間で、ラテラルフローアッセイ(LFA)やマイクロ流体紙ベースの分析デバイス(μPAD)などの紙ベースのイムノアッセイは、その簡便性、迅速性、安価さ、特異性から、診断テストとして人気を博しています17,18,19。紙ベースのイムノアッセイでは、金ナノ粒子(AuNP)20、磁性ナノ粒子21,22、量子ドット23、蛍光物質24,25など、いくつかの標識がシグナルを生成するために使用されています。AuNPは、製造コストが安価で、製造が容易で、安定性があり、読み出しが簡単なため、紙ベースのイムノアッセイで使用される最も一般的な標識です。現在、デング熱NS1のラテラルフローアッセイ(LFA)は、臨床現場で使用されていることで有名です26,27。しかし、従来のLFAラベル検出は肉眼で行うのが一般的で、定性的な結果しか得られません。
過去10年間で、50億台以上のスマートフォンが世界中で広く使用されており、ポータブル検出を開発する可能性があります28,29。スマートフォンは、内蔵の物理センサ、マルチコアプロセッサ、デジタルカメラ、USBポート、オーディオポート、ワイヤレス、およびアプリケーションソフトウェアなどの多機能容量を有しており、様々なバイオセンサプラットフォームでの使用に適している30。さらに、無線技術により、データを迅速に送信することができ、リアルタイムおよびオンサイト監視に使用することができる31。Mudanyaliらは、紙ベースのイムノアッセイとスマートフォンを組み合わせて、マラリア、結核、HIV用のポータブルで機器不要、迅速、低コスト、ユーザーフレンドリーなPOCTプラットフォームを開発しました32。Lingらは、牛乳中のアルカリホスファターゼ活性を定量的に検出するために、スマートフォンのカメラと組み合わせたラテラルフローアッセイを報告しました33。Houらは、ラテラルフローアッセイにおける色または蛍光からの定量的シグナルのためのスマートフォンベースのデュアルモダリティイメージングシステムも開発した34。さらに、スマートフォンを比色および定量的リーダーとして使用すると、肉眼ではターゲット35の存在を自信を持って報告できない一方で、感度を向上させることができる。
デング熱診断のブレークスルーを示すDEN-NS1-PAD36,37,38(以下、デバイスと呼ぶ)は、ポータブルで効率的なソリューションを提供します。ワックス印刷によるマイクロ流体紙ベースの技術を用いて、画像処理によりNS1を高感度かつ特異的に定量する装置です。その実用性をさらに高めるために、比色測定と定量読み取りのためのユーザーフレンドリーなスマートフォンアプリを開発しました。タイの病院からの患者サンプルを使用した臨床検証は、リアルタイムの患者評価への直接的な影響を強調しています。当社のイノベーションは、合理化されたポイントオブケアデング熱管理における極めて重要な進歩を示し、リソースが限られている医療環境における診断に革命を起こすことを約束します。
Protocol
Representative Results
Discussion
スマートフォンベースのリーダーシステムの重要な設計パラメータの1つは、サンプルの再現性のある画像処理を提供する能力です。この研究では、シンプルさと利便性のために、イメージングボックスやアクセサリを使用せずに、12〜13MPカメラを搭載した3つの異なるスマートフォンブランドから画像をキャプチャしました。カメラの解像度、画像撮影時間、照明条件、環境など、画像キャ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.H.P.は、インドネシア・イスラム大学(UII)からの奨学金研究基金に感謝しています。著者らは、モバイルアプリケーションの開発と原稿への貢献を通じて、貴重な専門知識と支援をしてくれたNutchanon Ninyawee氏に感謝の意を表します。さらに、タイ科学研究イノベーション(TSRI)の2023年度基礎研究費(プロジェクト番号。FRB660073/0164)は、モンクット王工科大学トンブリ校のプログラムスマートヘルスケアの下で。
Materials
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10×30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
Referências
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