आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके वायरस से संक्रमित मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर्स की लाइव कैल्शियम इमेजिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल वायरस से संक्रमित मानव आंतों के ऑर्गेनोइड में कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है और विश्लेषण के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Abstract
कैल्शियम सिग्नलिंग लगभग हर ऊतक का एक अभिन्न नियामक है। आंतों के उपकला के भीतर, कैल्शियम स्रावी गतिविधि, एक्टिन गतिशीलता, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, स्टेम सेल प्रसार और कई अन्य अनियंत्रित सेलुलर कार्यों के नियमन में शामिल है। जैसे, आंतों के उपकला के भीतर कैल्शियम सिग्नलिंग गतिशीलता मानचित्रण होमोस्टेटिक सेलुलर प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है और विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए अद्वितीय प्रतिक्रियाओं का अनावरण कर सकता है। मानव आंतों के ऑर्गेनोइड (एचआईओ) आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट, मानव-व्युत्पन्न मॉडल हैं और इस प्रकार कैल्शियम गतिशीलता की जांच के लिए एक उपयोगी प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह पत्र आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) के साथ एचआईओ को स्थिर रूप से स्थानांतरित करने, लाइव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करने और कैल्शियम संकेतों को सार्थक रूप से चिह्नित करने के लिए इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, 3-आयामी HIO को लेंटवायरस के साथ GCaMP6s, एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन-आधारित साइटोसोलिक GECI को स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यू किया गया था। इंजीनियर HIO को तब एकल-कोशिका निलंबन में फैलाया गया और मोनोलेयर के रूप में वरीयता दी गई। भेदभाव के बाद, एचआईओ मोनोलेयर्स रोटावायरस से संक्रमित थे और / या कैल्शियम प्रतिक्रिया को उत्तेजित करने के लिए ज्ञात दवाओं के साथ इलाज किया गया था। एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप एक तापमान नियंत्रित, humidified लाइव-इमेजिंग कक्ष के साथ फिट संक्रमित या दवा इलाज monolayers की लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए अनुमति दी. इमेजिंग के बाद, अधिग्रहित छवियों का स्वतंत्र रूप से उपलब्ध विश्लेषण सॉफ्टवेयर, इमेजजे का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। कुल मिलाकर, यह काम एचआईओ में सेलुलर सिग्नलिंग को चिह्नित करने के लिए एक अनुकूलनीय पाइपलाइन स्थापित करता है।
Introduction
कैल्शियम एक व्यापक रूप से संरक्षित दूसरा संदेशवाहक है जो सेलुलर फिजियोलॉजीको विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। शारीरिक स्थितियों में इसके मजबूत चार्ज, छोटे आकार और उच्च घुलनशीलता को देखते हुए, कैल्शियम प्रोटीन रचना का एक आदर्श मैनिपुलेटर है। यह कैल्शियम को एंजाइमेटिक, ट्रांसक्रिप्शनल या पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों में विद्युत रासायनिक संकेतों को स्थानांतरित करने का एक शक्तिशाली साधन बनाता है। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) और प्लाज्मा झिल्ली में सख्त कैल्शियम एकाग्रता ढाल एक उच्च ड्राइविंग बल बनाते हैं जो साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता में तेजी से बदलाव की अनुमति देता है। बफरिंग और सक्रिय परिवहन दोनों सहित कई तंत्र, इस ढाल को कसकर बनाए रखते हैं। जबकि सामान्य सेलुलर कार्यों के लिए आवश्यक है, यह रखरखाव ऊर्जावान रूप से महंगा है, जिससे यह विशेष रूप से तनाव 2 की स्थिति में अतिसंवेदनशील हो जाता है।
जैसे, साइटोसोल के भीतर कैल्शियम का डिसरेग्यूलेशन कई प्रकार के सेलुलर तनाव का एक निकट-सार्वभौमिक संकेत है। चयापचय संबंधी गड़बड़ी, विषाक्त पदार्थ, रोगजनकों, यांत्रिक क्षति, और आनुवंशिक गड़बड़ी सभी कैल्शियम सिग्नलिंग को बाधित कर सकते हैं। उत्तेजना के बावजूद, पूरे सेल स्तर पर, साइटोसोलिक कैल्शियम में निरंतर, अनियंत्रित वृद्धि एपोप्टोसिस और अंततः परिगलन 3,4 को बढ़ावा दे सकती है। कम आयाम या उच्च आवृत्ति के साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन, हालांकि, अलग-अलग प्रभाव हैं2. इसी तरह, कैल्शियम में उतार-चढ़ाव के परिणाम स्थानिक माइक्रोडोमेन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं जिसमें वे होते हैं5. कैल्शियम के स्तर की निगरानी इसलिए गतिशील संकेतन प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन इसके लिए अपेक्षाकृत उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ नमूना लेने की आवश्यकता होती है।
आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) लाइव-सेल सिस्टम6 में निरंतर नमूने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले जीईसीआई में से कुछ जीएफपी-आधारित कैल्शियम-उत्तरदायी फ्लोरोसेंट प्रोटीन हैं जिन्हें जीसीएएमपी7 के रूप में जाना जाता है। विहित GCaMP तीन अलग-अलग प्रोटीन डोमेन का एक संलयन है: एक गोलाकार रूप से अनुमति GFP (cpGFP), शांतोडुलिन और M136। शांतोडुलिन डोमेन कैल्शियम को बांधने पर एक रचना परिवर्तन से गुजरता है, जिससे एम 13 के साथ इसकी बातचीत की अनुमति मिलती है। शांतोडुलिन-एम 13 इंटरैक्शन सीपीजीएफपी में एक रचनात्मक परिवर्तन को प्रेरित करता है जो उत्तेजना पर इसके फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को बढ़ाता है। जैसे, कैल्शियम एकाग्रता में वृद्धि GCaMP प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि के साथ संबंधित है। ये सेंसर साइटोसोलिक हो सकते हैं या विशिष्ट जीवों को लक्षित कर सकते हैं8.
अधिकांश ऊतकों के समान, कैल्शियम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल एपिथेलियम के भीतर विभिन्न कार्यों को नियंत्रित करता है। आंतों के उपकला पोषक तत्व और द्रव अवशोषण के लिए अभिन्न अंग है, लेकिन रोगज़नक़ आक्रमण या विषाक्त अपमान से बचने के लिए एक तंग बाधा और प्रतिरक्षा इंटरफ़ेस भी बनाना चाहिए। कैल्शियम पर निर्भर रास्ते इनमहत्वपूर्ण कार्यों के लगभग सभी 9,10,11 को प्रभावित. हालांकि, आंतों के उपकला के भीतर कैल्शियम सिग्नलिंग एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में आशाजनक क्षमता के साथ एक अस्पष्टीकृत सीमा बनी हुई है। जबकि विवो में आंतों के उपकला के भीतर कैल्शियम गतिशीलता की निगरानी चुनौतियों पेश करने के लिए जारी है, मानव आंतों के organoids (HIOs) प्रयोग12 के लिए एक अनुकूलनीय पूर्व विवो प्रणाली की पेशकश. HIO 3 आयामी (3 डी) मानव आंतों स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न spheroids और, भेदभाव पर, देशी आंतों उपकला12 की सेलुलर विविधता के बहुत पुनरावृत्ति कर रहे हैं.
यह प्रोटोकॉल एचआईओ को इंजीनियर करने के लिए व्यापक तरीकों का वर्णन करता है जो जीईसीआई को व्यक्त करते हैं और फिर इंजीनियर एचआईओ को लाइव-सेल कैल्शियम इमेजिंग के लिए मोनोलेयर के रूप में तैयार करते हैं। यह वायरल संक्रमण को एक पैथोलॉजिकल हेरफेर के उदाहरण के रूप में प्रस्तुत करता है जो कैल्शियम सिग्नलिंग को बाधित करता है और इन परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए एक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
साइटोसोलिक सीए2+ स्तरों में परिवर्तन उपकला 10,16,17 के भीतर विकृति का कारण और प्रभाव दोनों हो सकता है। साइटोसोलिक कैल्शियम में वृद्धि सीधे18,19 TMEM16…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) से अनुदान R01DK115507 और R01AI158683 (पीआई: जेएम हाइसर) द्वारा समर्थित किया गया था। प्रशिक्षु समर्थन एनआईएच अनुदान F30DK131828 (पीआई: जेटी गेबर्ट), F31DK132942 (पीआई: एफजे स्क्रिबानो), और F32DK130288 (पीआई: केए एंगेविक) द्वारा प्रदान किया गया था। हम ऑर्गेनॉइड रखरखाव मीडिया प्रदान करने के लिए टेक्सास मेडिकल सेंटर पाचन रोग एंटॉइड कोर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
Referências
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