Multiplex cyklisk fluorescerende immunhistokemi
Summary
Multiplex cyklisk immunhistokemi tillader in situ detektion af flere markører samtidigt ved hjælp af gentagen antigen-antistofinkubation, billedscanning og billedjustering og integration. Her præsenterer vi driftsprotokollen til identifikation af immuncellesubstrater med denne teknologi i lungekræft og parrede hjernemetastaseprøver.
Abstract
Tumormikromiljøet involverer interaktioner mellem værtsceller, tumorceller, immunceller, stromale celler og vaskulatur. Karakterisering og rumlig organisering af immuncelleundergrupper og målproteiner er afgørende for prognostiske og terapeutiske formål. Dette har ført til udviklingen af multipleksede immunhistokemiske farvningsmetoder. Multiplexfluorescens immunhistokemi tillader samtidig påvisning af flere markører, hvilket letter en omfattende forståelse af cellefunktion og intercellulære interaktioner. I dette papir beskriver vi en arbejdsgang for multiplexcyklisk fluorescerende immunhistokemisk assay og dens anvendelse i kvantificeringsanalysen af lymfocytundergrupper. Den multiplex cykliske fluorescerende immunhistokemiske farvning følger lignende trin og reagenser som standard immunhistokemi, der involverer antigenhentning, cyklisk antistofinkubation og farvning på et formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) vævsglas. Under antigen-antistofreaktionen fremstilles en blanding af antistoffer fra forskellige arter. Betingelser, såsom antigenhentningstid og antistofkoncentration, optimeres og valideres for at øge signal-støj-forholdet. Denne teknik er reproducerbar og fungerer som et værdifuldt værktøj til immunterapiforskning og kliniske anvendelser.
Introduction
Hjernemetastaser (BM) repræsenterer de mest almindelige tumorer i centralnervesystemet (CNS), der forekommer i næsten halvdelen af ikke-småcellet lungekræft tilfælde (NSCLC), med en dårlig prognose1. Det anslås, at 10%-20% af NSCLC-patienterne allerede har BM på tidspunktet for den første diagnose, og ca. 40% af NSCLC-tilfældene vil udvikle BM i løbet af behandling2. Tumormikromiljøet (TME) er tæt forbundet med NSCLC-forekomst og BM, herunder forskellige komponenter, såsom blodkar, fibroblaster, makrofager, ekstracellulær matrix (ECM), lymfoid, knoglemarvsafledte immunceller og signalmolekyler 3,4. Mikromiljømæssige immunceller spiller en afgørende rolle i at påvirke kræftcellevækst og udvikling. Hjernemetastaser præsenterer adskillige potentielle behandlingsmål præget af komplekse immunologiske mikromiljøer og signalprocesser. For eksempel har PD-1-hæmmere vist klinisk effekt hos patienter med lungekræft hjernemetastase (LCBM) som en immun-checkpoint-hæmmer (ICI). Imidlertid varierer hyppigheden af respons på PD-1-behandling mellem primær NSCLC og LCBM5, hvilket tyder på, at tumorimmunmikromiljøet fungerer som en kritisk ICI-regulator.
Immunohistokemi (IHC) er et uvurderligt værktøj inden for biologi, grundmedicin og patologi6. Denne detektionsmetode visualiserer antigenekspression gennem interaktionen mellem antigen-antistof på et vævsglas7. IHC bruges til diagnosticering af prædiktive markører, evaluering af prognostiske markører, vejledning af målrettede terapier og udforskning af tumorcellernes biologiske funktioner8. Den traditionelle IHC-metode kan dog kun detektere én biomarkør ad gangen. For at imødegå denne begrænsning har innovationen af immunhistokemisk teknologi ført til udviklingen af multiplex fluorescens immunohistokemi (mfIHC), som muliggør samtidig identifikation af flere proteinmarkører på det samme vævsglas, både i lyst felt og fluorescerende felt9. Dette fremskridt giver nøjagtig analyse af cellesammensætning og molekylære interaktioner mellem stromale celler, immunceller og kræftceller inden for TME.
I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol for multiplex cyklisk immunhistokemi til analyse af den rumlige fordeling af immunceller. To primære antistoffer af forskellige arter, såsom kanin og rotte, vælges til inkubation samtidigt, efterfulgt af fluorescensmærkede sekundære antistoffer. Antigenudtagning udføres efter hver runde af antigen-antistofreaktion. Autofluorescens er blokeret, og 4′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) anvendes til farvning af kernerne. Panelet inkluderer sekventiel påvisning af CD3, CD8, CD20 og CK, celler kategoriseres efter markørerne: tumorceller (CK +), modne T-celler (CD3 +), cytotoksiske T-celler (CD3 + CD8 +), B-celler (CD20 +) 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet processen for multiplex cyklisk fluorescens immunohistokemisk farvning. Den primære antistofudvælgelse er et afgørende aspekt af fluorescensimmunohistokemisk assay, og monoklonale antistoffer anbefales for bedre specificitet og repeterbarhed. For at optimere arbejdskoncentrationen af det primære antistof er en række fortyndinger blevet testet gennem immunohistokemiske eksperimenter. Både positive kontroller (til vurdering af målantigenekspression) og negative kontroller (ingen primær antistofinku…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Scientific Research Foundation of Education Department of Yunnan Province (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
Referências
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
