Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Summary

Aqui, propomos três métodos diferentes de danificar as fibras sensoriais que inervam a córnea. Estes métodos facilitam o estudo da regeneração axonal em camundongos. Estes três métodos, adaptáveis a outros modelos animais, são ideais para o estudo da fisiologia e regeneração da inervação corneana.

Abstract

A córnea é um tecido transparente que cobre o olho e é crucial para uma visão clara. É o tecido mais inervado do corpo. Essa inervação proporciona sensação e função trófica ao olho e contribui para preservar a integridade corneana. A ruptura patológica dessa inervação é denominada ceratite neurotrófica. Isso pode ser desencadeado por lesão no olho, cirurgia ou doença. Neste estudo, propomos três diferentes protocolos para causar dano à inervação de forma a recapitular os três tipos de casos geralmente encontrados na clínica.

O primeiro método consiste em fazer uma abrasão do epitélio com uma broca oftálmica. Trata-se da remoção da camada epitelial, das terminações nervosas livres e do plexo subbasal de forma semelhante à cirurgia de ceratectomia fotorrefrativa realizada na clínica. O segundo método visa apenas a inervação seccionando-a na periferia com um punch de biópsia, mantendo a integridade do epitélio. Este método é semelhante aos primeiros passos da ceratoplastia lamelar e leva a uma degeneração da inervação seguida de recrescimento dos axônios na córnea central. O último método danifica a inervação de um modelo de camundongo transgênico usando um microscópio multifóton, que localiza especificamente o local de cauterização das fibras nervosas fluorescentes. Este método inflige o mesmo dano que a fotoceratite, uma superexposição à luz UV.

Este estudo descreve diferentes opções para investigar a fisiopatologia da inervação corneana, particularmente a degeneração e regeneração dos axônios. Promover a regeneração é crucial para evitar complicações como defeitos do epitélio ou mesmo perfuração da córnea. Os modelos propostos podem ajudar a testar novas moléculas farmacológicas ou terapia gênica que melhoram a regeneração nervosa e limitam a progressão da doença.

Introduction

A córnea, que é a superfície transparente do olho, é composta por três camadas distintas: o epitélio, o estroma e o endotélio. Este órgão possui a maior densidade de inervação do corpo e é composto principalmente por fibras sensitivas (tipos Aδ e C) originárias do ramo oftálmico do gânglio trigeminal. As fibras sensoriais penetram na periferia da córnea no estroma médio na forma de grandes feixes que se ramificam para cobrir a superfície. Eles então se bifurcam para perfurar a membrana de Bowmann e formam o plexo subbasal, que é facilmente reconhecível pela formação de um vórtice no centro da córnea. Essas fibras terminam como terminações nervosas livres na superfície....

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo National Animal Experiment Board.

1. Preparações

1. Preparar uma solução anestésica de ketamina-xilazina para anestesia. Injetar cetamina a 80 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg diluindo 200 μL de cetamina (100 mg/mL) e 125 μL de xilazina (20 mg/mL) em 2.175 mL de NaCl 0,9% estéril.
2. Preparar 0,02 mg/mL de solução de buprenorfina como solução analgésica adicionando 100 μL de buprenorfina a 0,3 mg/mL a 1.400 mL de NaCl 0,9% estéril.
3. Prepare a solução de coloração fluorescente.
   1. Use uma balança fina para pesar 10 mg de sal fluoresceína e dilua-o em 1....

Results

Este estudo propõe vários protocolos para causar danos à inervação corneana em camundongos. Embora protocolos semelhantes tenham sido utilizados para investigar a fisiopatologia da cicatrização do epitélio, optamos por adaptar e desenvolver novos métodos de investigação da regeneração da inervação corneana. Para a observação da inervação, foram utilizadas duas técnicas. Primeiro, empregamos uma técnica de imunofluorescência para corar as fibras nervosas usando um anticorpo pan-neuronal (tubulina BIII) e os núcleos com um.......

Discussion

A ceratite neurotrófica é considerada uma doença rara, afetando 5 em cada 10.000 indivíduos. No entanto, pessoas que sofrem de NK devido a uma lesão física, como queimaduras químicas, ou síndromes, como diabetes ou esclerose múltipla, não são incluídas nessas^{estatísticas3}. Além disso, essa condição permanece significativamente subdiagnosticada²², e a prevalência da doença é subestimada. Há uma forte necessidade de novos tratamentos e terapias que promovam a regeneração axon.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 µ filtro de seringa m	CLEARLINE	51733
removedor de anel de ferrugem de 0,5 mm	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL tubos de plástico	Eppendrof
Rebarba Algerbrush, Instrumento completo	Alger Equipment Company	BR2-5
Anticorpo anti-beta III Tubulina	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Lágrima artificial	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotonete	Qualquer provedor	N / A
Ferramentas de dissecação	Ferramentas de ciência fina	N / A
Fluoresceína	Merck	103887
Gelatina de pele de peixe de água fria	Sigma	G7765
Soro de cabra	Merck	S26
Suporte de cabeça	Narishige	SGM 4
Placa aquecida	Instrumentos BIOSEB LAB	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM SAÚDE ANIMAL França	N/A	Autorização de introdução no mercado francesa número: FR/V/0167433 4/1992
Software LAS X	Leica	N/A	Processo de limpeza computacional de grande volume (LVCC)
Laser Chameleon Ultra II	Coerente	N/A
Medidor de potência a laser	Coerente	N/A
Leica Thunder Imager Microscópio de tecido	Leica	N/A
Multi-fóton Zeiss LSM 7MP microscópio vertical	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Oscilador paramétrico	Coerente	N/A
Lanternas com azul tampa de filtro de cobalto	Bernell	ALPEN
Placa de Petri	Thermo Scientific	150318	Protocolo de axotomia
Petridish	Thermo Scientific	150288	Córnea processamento de montagem completa
Rompun 2%	Elanco	N/A	Autorização de introdução no mercado francesa número: FR/V/8146715 2/1980
Punção de biópsia estéril 2,5 mm	LCH médico	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Meio de montagem