Här föreslår vi tre olika metoder för att skada de sensoriska fibrerna som innerverar hornhinnan. Dessa metoder underlättar studier av axonregenerering hos möss. Dessa tre metoder, som är anpassningsbara till andra djurmodeller, är idealiska för studier av hornhinnans innervationsfysiologi och regenerering.
Hornhinnan är en genomskinlig vävnad som täcker ögat och är avgörande för klar syn. Det är den mest innerverade vävnaden i kroppen. Denna innervation ger känsel och trofisk funktion till ögat och bidrar till att bevara hornhinnans integritet. Den patologiska störningen av denna innervation kallas neurotrofisk keratit. Detta kan utlösas av skada på ögat, operation eller sjukdom. I denna studie föreslår vi tre olika protokoll för att tillfoga skada på innernervationen på ett sätt som rekapitulerar de tre typer av fall som vanligtvis förekommer i kliniken.
Den första metoden består i att göra en nötning av epitelet med en oftalmisk burr. Detta innebär avlägsnande av epitelskiktet, de fria nervändarna och den subbasala plexus på ett sätt som liknar den fotorefraktiva keratektomioperationen som utförs på kliniken. Den andra metoden riktar sig endast mot innervationen genom att snitta den i periferin med en biopsistans, vilket bibehåller epitelets integritet. Denna metod liknar de första stegen i lamellär keratoplastik och leder till en degeneration av innervationen följt av återväxt av axonerna i den centrala hornhinnan. Den sista metoden skadar innervationen av en transgen musmodell med hjälp av ett multifotonmikroskop, som specifikt lokaliserar platsen för kauterisering av de fluorescerande nervfibrerna. Denna metod orsakar samma skada som fotokeratit, en överexponering för UV-ljus.
Denna studie beskriver olika alternativ för att undersöka fysiopatologin vid hornhinnans innervation, särskilt degeneration och regenerering av axonerna. Att främja regenerering är avgörande för att undvika sådana komplikationer som epiteldefekter eller till och med perforering av hornhinnan. De föreslagna modellerna kan hjälpa till att testa nya farmakologiska molekyler eller genterapi som förbättrar nervregenerering och begränsar sjukdomsprogression.
Hornhinnan, som är ögats genomskinliga yta, består av tre distinkta lager: epitelet, stromat och endotelet. Detta organ har den högsta tätheten av innervation i kroppen och består huvudsakligen av sensoriska fibrer (typ Aδ och C) som härrör från den oftalmiska grenen av trigeminusgangliet. Sensoriska fibrer tränger in i hornhinnans periferi i mitten av stromat i form av stora knippen som förgrenar sig för att täcka ytan. De förgrenar sig sedan för att tränga igenom Bowmanns membran och bildar den subbasala plexus, som är lätt att känna igen genom bildandet av en virvel i mitten av hornhinnan. Dessa fibrer slutar som fria nervändar på epitelets yttre yta. De kan överföra termiska, mekaniska och kemiska stimuli och frigöra trofiska faktorer som är väsentliga för epitelhomeostas 1,2. Neurotrofisk keratit (NK) är en degenerativ sjukdom som påverkar hornhinnans sensoriska innervation. Denna sällsynta sjukdom härrör från en minskning eller förlust av hornhinnans känslighet som resulterar i lägre tårproduktion och dåliga läkande egenskaper hos hornhinnan3. NK utvecklas genom tre väl beskrivna stadier, från stadium 1 där patienter drabbas av epiteldefekter, till stadium 3 där stromasmältning och/eller hornhinneperforering sker4.
Kliniskt kan ursprunget till denna sjukdom vara olika. Patienter kan förlora hornhinnans innervation efter fysisk skada på ögat, kirurgi eller genom kroniska sjukdomar, såsom diabetes 5,6. Hittills är NK-patogenesprocessen fortfarande dåligt förstådd, och terapeutiska alternativ för detta synhotande tillstånd är mycket begränsade. Därför behövs en bättre förståelse för egenskaperna hos epiteldefekter för att bättre förstå mekanismerna bakom regenereringen av dessa fibrer och potentiellt främja dem. Här föreslår vi flera modeller av hornhinneskador som inducerar NK hos möss.
Den första modellen är nötning av hornhinnans epitelskikt med en okulär borr. Denna modell har främst studerats i samband med regenerering av epitelet hos olika djur, såsom gnagare och fiskar 7,8,9, och för att testa molekyler som främjar hornhinnans läkning10,11. Fysiologiskt tar det 2-3 dagar för epitelcellerna att stänga såret. Det fysiologiska mönstret för innervationen tar dock mer än fyra veckor att återhämta sig från nötningen12,13. Under operationen tar den okulära borren bort hornhinnans epitelskikt som innehåller subbasal plexus och fibrernas fria nervändar. Denna procedur kan kliniskt jämföras med patienter med fotorefraktiv keratektomi (PRK) för att korrigera ögonbrytningsdefekter. Proceduren består av att ta bort hornhinnans epitel och sedan omforma stromat med en laser14. Patienter kan uppleva flera biverkningar efter sådan operation, såsom en minskning av hornhinnans nervtäthet i 2 år och en minskning av känsligheten under en period av 3 månader till ett år efter operationen15. Med tanke på att operationen inducerar en bräcklighet i hornhinnans mikromiljö, kan denna modell hjälpa till att undersöka dessa biverkningar och utveckla terapeutiska metoder som skulle främja snabbare reinnervering och därmed minska biverkningarna i fråga.
Den andra modellen består av att snitta axonerna i hornhinnans periferi med en biopsistans, vilket inducerar en wallersk degeneration av den centrala innervationen 16. Kliniskt kan denna metod jämföras med främre lamellär keratoplastik, där kirurgen realiserar en partiell trepanering av hornhinnan för att ta bort en del av hornhinnans främre tjocklek och ersätta den med en donatortransplantation 17. Efter lamellär keratoplastik kan patienter drabbas av ett antal symtom, inklusive torra ögon, förlust av hornhinneinnervation och transplantatavstötning18. Denna axotomimodell utförd på hornhinnans nerver kan ge insikt i mekanismerna för fiberdegeneration, som sker efter ett transplantat, följt av axonernas regenerering.
Den tredje metoden skadar hornhinnans nerver med laser. Genom att använda ett multifotonmikroskop på hornhinnan hos sövda djur induceras degeneration av nerverna lokaliserade i det optiska fältet som ett resultat av bildning av reaktiva syrearter (ROS), vilket leder till DNA-skador och cellulära kavitationer19. Denna metod rekapitulerar hornhinnans fotoskada som induceras av överexponering för naturlig UV (solbränna), vilket också utlöser ROS-bildning, vilket leder till DNA-skador20. Patienter som lider av solbränna på hornhinnan upplever stor smärta, eftersom försämringen av epitelcellerna berövar hornhinnans extremiteter allt.
De tre metoderna som beskrivs här är utformade för att möjliggöra undersökning av NK-patogenesprocessen och axonregenerering. De är lätta att reproducera och exakta. Dessutom möjliggör de snabb återhämtning och enkel övervakning av djuren.
Neurotrofisk keratit anses vara en sällsynt sjukdom som drabbar 5 av 10 000 individer. Personer som lider av NK på grund av en fysisk skada, t.ex. kemiska brännskador, eller syndrom som diabetes eller multipel skleros ingår dock inte i denna statistik. Dessutom är detta tillstånd fortfarande kraftigt underdiagnostiserat22, och förekomsten av sjukdomen är underskattad. Det finns ett stort behov av nya behandlingar och terapier som skulle främja axonregenerering som …
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr. Karine Loulier för tillgången till den transgena muslinjen MAGIC-Markers. Författarna tackar också RAM-Neuro animal core facility och imaging facility MRI, en medlem av den nationella infrastrukturen France-BioImaging som stöds av den franska nationella forskningsbyrån (ANR-10-INBS-04, “Investments for the future”). Denna forskning stöddes av ATIP-Avenir-programmet, Inserm, Région Occitanie, universitetet i Montpellier, den franska nationella forskningsbyrån (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) och Groupama Foundation.
0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
Antigenfix | Diapath | P0016 | |
Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
Buprecare | Animalcare | N/A | |
Cotton swab | Any provider | N/A | |
Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
Fluorescein | Merck | 103887 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
Goat serum | Merck | S26 | |
Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
Laser power meter | Coherent | N/A | |
Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
Triton X-100 | VWR | 0694 | |
Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |